Có hai phương pháp bảo quản in vitro: bảo quản sinh trưởng tối thiểu và bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời
- Phương pháp bảo quản sinh trưởng tối thiểụ
+ Nguyên lý: mẫu được bảo quản trong điều kiện bảo quản sao cho tốc độ sinh trưởng của mẫu giảm tới mức tối thiểụ
+ Đặc điểm:
• Đặc điểm của phương pháp này là kéo dài thời gian giữa hai lần cấy chuyển nhờ ức chế sinh trưởng của mẫu cấy để giảm tới mức tối thiểu chi phí trong quá trình bảo quản.
• Trong thời gian bảo quản mô và tế bào thực vật vẫn tiếp tục sinh trưởng nhưng với tốc độ rất chậm.
• Thời gian bảo quản sinh trưởng chậm có thể kéo dài một vài năm.
+ Đối tượng: phương pháp này thường áp dụng cho việc bảo quản ngắn hạn các cây nhân giống in vitro (chuối, dứa, khoai tây, khoai lang…). Mẫu đưa vào bảo quản thường ở các dạng phôi, chồi, mầm, cây con.
+ Các bước tiến hành:
• Đưa mẫu vào môi trường nuôi cấy có bổ sung các nhân tố nhằm ức chế sinh trưởng. Các nhân tố gây ức chế sinh trưởng thường dùng là:
Giảm nhiệt độ của phòng nuôị Với loài cây chịu lạnh nhiệt độ bảo quản từ 0÷50 C.
Ví dụ: chồi cây thông và cây táo giữ được 52 tuần ở 20C, khoai tây bảo quản ở
6÷120C có thời gian cấy chuyển là 25÷52 tuần. Những loài cay nhiệt đới thường bảo quản ở nhiệt độ cao hơn. Ví dụ: chuối giữ được 15 tháng ở 150C, cọ dầu bảo quản ở
180C.
Chất ức chế sinh trưởng: bổ sung vào môi trường nuôi cấy ABA (axit abcisic),
CCC (Clo Cholin Clorit).
Chất gây áp suất thẩm thấu: manitol, sorbitol, saccarosẹ
Thay đổi điều kiện nuôi cấy: giảm cường độ chiếu sáng, giảm nồng độ ôxi…
Ví dụ: nuôi cấy khoai tây ở 220C và môio trường có 5÷10mg/l ABA thì thời gian cấy chuyển kéo dài tới 12 tháng; cây sắn nuôi cấy ở 200C trong môi trường có 4% saccarose có thể kéo dài thời gian cấy chuyển tới 15 tháng.
• Khi kết thúc một giai đoạn bảo quản, mẫu bảo quản cần được chuyển sang môi trường mới pha chế và đặt trong điều kiện tối thích một thời gian ngắn để kích thích sự tái sinh trưởng của mẫu trước khi bắt đầu một chu kỳ bảo quản mớị
Ví dụ: bảo quản sinh trưởng chậm cây khoai tây Thời gian chuẩn bị mẫu: 8 tuần. Thời gian bảo quản: 2 năm. Nhiệt độ: 100
C.
Thời gian chiếu sáng:16h. Cường độ chiếu sáng: 1500lux. Độ ẩm: 60÷70%.
- Phương pháp bảo quản ngừng sinh trưởng tạm thời
+ Nguyên lý: bảo quản mẫu bằng cách làm mẫu ngừng sinh trưởng tạm thờị + Đặc điểm:
• Đặc điểm của kỹ thuật này là mẫu nuôi cấy được bảo quản trong nitơ lỏng, và trong thời gian bảo quản tế bào mô hoàn toàn ngừng sinh trưởng.
• Có thể bảo quản mẫu được 20÷30 năm hoặc lâu hơn.Trước khi đưa vào bảo quản mẫu cần được xử lý để tránh tạo thành các tinh thể nước kết tinh gây chết mẫụ + Đối tượng: mẫu đem bảo quản thường ở dạng phôi, mô sẹo, các mô nuôi cấy…
+ Các bước tiến hành:
• Nuôi cấy in vitro và tách mẫu ở pha tăng trưởng mạnh để đưa vào bảo quản. • Xử lý chống đông cho tế bào, mô của mẫu cấy: mẫu được xử lý bằng dung dịch 5÷10% prolin, manitol 3÷6% có bổ sung chất chống đông là dung dịch DMSO 1M+ glycerol 1M+ đường saccarose 2M…
• Xử lý lạnh đến nhiệt độ đông băng ổn định của tế bào chất (-30÷-400 C)
Mẫu sau thời gian bảo quản khi lấy ra được phá băng ở nhiệt độ 37÷400C. Mẫu sẽ được phục hồi sinh trưởng và có thể tiếp tục nuôi cấy để tạo cây hoàn chỉnh.
Chuyên đề 8. Vì sao có thể chuyển gen vào cây trồng thông qua vi khuẩn