CHƢƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2. Phương pháp nghiên cứu:
2.3. Phân tích mẫu
2.3.4. Điện di trên máy điện di mao dẫn (Capillary Electrophoresis CE)
* Nguyên lý
Vào cuối những năm 1980, điện di mao dẫn bắt đầu được sử dụng và vào giữa những năm 1990 người ta bắt đầu sản xuất các máy điện di mao dẫn. Kể từ đó kỹ thuật điện di mao dẫn phát triển nhanh chóng và ngày càng phổ
biến. Hiện nay đã có nhiều loại máy điện di mao dẫn được sử dụng tại các phòng thí nghiệm sinh học phân tử cũng như các phòng giám định gen hình sự như: ABI Prism 310 Genetic Analyzer với một mao quản, ABI Prism 3100Avant Genetic Analyzer với 4 mao quản, ABI Prism 3700 Genetic Analyzer với 4 mao quản, ABI Prism 3130 Genetic Analyzer với 4 mao quản, ABI Prism 3130XL Genetic Analyzer với 16 mao quản …[6]
Nguyên lý của điện di mao dẫn là dùng tia lase kích hoạt các đoạn ADN khuôn đã được gắn huỳnh quang để thu được các phổ quang học. Điểm khác của điện di mao dẫn là sử dụng mao quản có chứa gel, tia lase chỉ chiếu vào một điểm cố định trên mao quản cho từng mẫu một [6, 16]. Các cặp mồi được đánh dấu bằng các chất nhuộm huỳnh quang khác nhau vì vậy sản phẩm sau PCR có các locus gen được gắn các chất nhuộm huỳnh quang tương ứng. Kỹ thuật hiện màu huỳnh quang cho xác định được màu xanh da trời, xanh lá cây, vàng, đỏ, cam tương ứng với các chất đánh dấu: 6 - FAM, VIC, NED, PET và LIZ, dựa trên sự hấp thụ và phát xạ ánh sáng của các chất nhuộm màu huỳnh quang này. Các hạt huỳnh quang hấp thụ năng lượng từ nguồn sáng laze sau đó phát xạ ánh sáng ở mức năng lượng thấp hơn (bước sóng cao hơn). Một màng lọc sáng được sử dụng để lọc ánh sáng ở những bước sóng xác định hoặc một khoảng bước sóng nào đó [6].
Hình 2. Các locus gen hệ Identifiler * Tiến hành
Chuẩn bị mẫu trước khi điện di: Thành phần và tỷ lệ thể tích từng hỗn hợp phản ứng như sau:
Bảng 2.5. Thành phần của hỗn hợp điện di
Thành phần Thể tích
Hi-Di™ Formamide 8,5 µl
GeneScan™ 500 LIZ® 0,3 µl Sản phẩm PCR hoặc thang alen 1,5 µl
Tổng 10,3 µl D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO D3S1358 TH01 D13S317 D16S539 D2S1338 D19S433 D18S51 TPOX VWA AMEL D5S818 FGA
GS500 LIZ size standard 6FAM (blue) VIC (green) NED (yellow) PET (red) LIZ (orange) AmpFlSTR® Identifiler™
120 sản phẩm PCR được tiến hành xác định kiểu gen bằng phương pháp điện di mao dẫn trên máy giải trình tự gen AB 3130 của hãng Applied Biosystem. Kết quả thu được được xử lý bằng phần mềm Genemapper ID 3.2 để xác định kiểu gen của mỗi mẫu, từ đó cho ta bảng số liệu tập hợp kiểu gen của 120 cá thể người H’Mông.