.Đánh giáđa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử

2.3 .Phương pháp nghiên cứu

2.3.1.1 .Đánh giáđa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử

Tách chiết DNA tổng số

Mẫu lá non được thu từ cây lúa sau 30 ngày kể từ ngày cấy.

Các bước tiến hành tách chiết DNA

DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Cheng và cộng sự (2003) [18]. Quy trình tách chiết được tiến hành với các bước như sau:

Bước 1: Nghiền 1,5 - 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ.

Bước 2: Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml đệm chiết CTAB (đã được làm nóng đến 65oC).

Bước 3: Ủ mẫu đảo đều và ủ mẫu ở 65oC trong thời gian 60 phút, 10 phút đảo đều một lần.

Bước 4: Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Bổ sung 4 ml Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.

Bước 5: Chuyển dịch trong phía trên ống falcon sang một ống mới (4ml). Bổ sung một thể tích tương đương (4ml) Isopropanol, đảo đều, giữ ở nhiệt độ - 200C trong 30 phút.

Bước 6: Tủa DNA bằng máy ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa tủa 2 - 3 lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%.

Bước 7: Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml đệm TE và 15 µl RNase A (10 mg/ml). Ủ ở 37oC trong 3h.

Bước 8: Chuyển dung dịch DNA vào một ống mới. Thêm 2 ml phenol - chloroform - isoamyl alcohol (25:24:1), đảo đều trong 5 - 10 phút và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.

Bước 9: Chuyển phần dịch phía trên vào ống mới. Thêm 750 µl NaCl 5M và 3ml Ete bão hòa hơi nước. Trộn đều và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.

Bước 10: Loại bỏ lớp Ete bên trên. Chuyển phần bên dưới vào ống mới Thêm 3 ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở -20°C trong 30 phút. Lấy DNA ra bằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh.

Bước 11:Rửa tủa 3 lần với 1.5 ml ethanol 70%.

Bước 12: Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 800 µl đệm TE để hòa tan tủa. Giữ dung dịch DNA ở - 20°C.

Đo độ tinh sạch của DNA

Sau khi tách chiết, độ tinh sạch và nồng độ của DNA được đánh giá bằng phương pháp điện di trên agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5X và dùng DNA nồng độ (50 ng/µl) làm thang chuẩn, trong 30 phút, điện thế 100V. Sau khi chạy điện di, tiến hành nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm ethidium bromide. Việc chụp mẫu và đo nồng độ được thực hiện bằng máy

Molecular imager FX.

 Phương pháp PCR với mồi SSR

Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Mastercycler – personal và được trình bày trong bảng 2.6:

Bảng 2.6. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR

Stt Thành phần Thể tích (l)

1 H2O cất khử trùng 8.95

2 Buffer 10X 1,5

3 MgCl2 (50mM) 0,45

4 dNTP (1mM) 1,0

5 Taq DNA polymeraza (5U) 0,1

6 Primer forward 5M 0,5

7 Primer Revert 5M 0,5

8 DNA (35ng/ l) 2,0

Tổng thể tích: 15

hi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:

Bảng 2.7 : Chương trình chạy của phản ứng PCR

Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ

1 94 5 phút 1 2 94 30 giây 35 55* 30 giây 72 45 giây 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1

(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể.

 Phương pháp điện di

Bột Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm TBE 0.5X với nồng độ 3.0%.

- Đun sôi dung dịch agarose bằng lò vi sóng.

- Hạ nhiệt độ của gel agarose xuống khoảng 500C.

- Bổ sung Ethidium bromide (EtBr) với nồng độ 0.5µg/ml. - Chuẩn bị khay gel và lược.

- Rót hỗn hợp gel agarose EtBr vào khay gel và cắm lược. Thời gian chờ gel đông là 45 - 60 phút.

- Tra sản phẩm PCR.

- Chuẩn bị dung dịch đệm TBE 0.5X cho vào bể chạy điện di. - Chạy điện di tại 100mA trong 4 giờ.

- Rửa gel trong H2O, đặt gel vào máy soi UV và chụp ảnh.