2.1. Vật liệu nghiên cứu
Vật liệu sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: 20 dòng lúa ở thế hệ M6 được chọn lọc từ quần thể gây đột biến giống lúa thơm Sóc Trăng 19 (ST19) và 4 dòng lúa thế hệ M6 được chọn lọc từ các dòng đột biến của giống Q2 kế thừa từ đề tài độc lập cấp nhà nước, mã số ĐT.ĐL-G36.2012. Do NCS – Hoàng Thị Loan cung cấp (Bảng 2.1).
Bảng 2.1. Các dòng đột biến và giống gốc được nghiên cứu
TT Tên dòng/giống Liều chiếu TT Tên dòng/giống Liều chiếu
1 ST19 ĐC 14 Dòng số 13 300 Gy 2 Dòng số 1 200 Gy 15 Dòng số 14 300 Gy 3 Dòng số 2 200 Gy 16 Dòng số 15 300 Gy 4 Dòng số 3 200 Gy 17 Dòng số 16 350 Gy 5 Dòng số 4 250 Gy 18 Dòng số 17 350 Gy 6 Dòng số 5 250 Gy 19 Dòng số 18 350 Gy 7 Dòng số 6 250 Gy 20 Dòng số 19 350 Gy 8 Dòng số 7 250 Gy 21 Dòng số 20 350 Gy 9 Dòng số 8 250 Gy 22 Q2 ĐC 10 Dòng số 9 250 Gy 23 Q2-1 350 Gy 11 Dòng số 10 250 Gy 24 Q2-2 350 Gy 12 Dòng số 11 250 Gy 25 Q2-3 350 Gy 13 Dòng số 12 300 Gy 26 Q2-4 350 Gy
2.2. Nội dung nghiên cứu
Đánh giá một số đặc điểm hình thái nông học chính của 20 dòng lúa đột biến được tạo ra từ giống ST19 và 4 dòng lúa đột biến từ giống Q2. So sánh với giống gốc.
Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử SSR. Các dòng đột biến so với giống gốc.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nghiên cứu đồng ruộng
Thí nghiệm được bố trí theo phương pháp tuần tự không lặp lại mỗi ô thí nghiệm.
- Bố trí thí nghiệm đánh giá tập đoàn theo phương pháp tuần tự không nhắc lại, diện tích ô 2,5m2 (1 x 2,5 m).
- Mật độ: 45 khóm/m2.
- Các khâu kỹ thuật trồng và chăm sóc theo đại trà sản xuất.
- Đánh giá và so sánh các dòng đột biến thu được ở M6 so với giống đối chứng là ST19, các định dòng ưu việt theo mục tiêu nghiên cứu, các dòng còn phân ly thì loại bỏ.
Phương pháp đánh giá một số tính trạng nông Sinh học và yếu tố cấu thành năng suất, chất lượng.
Các tính trạng theo dõi và đánh giá được thực hiện theo Hệ thống đánh giá tiêu chuẩn cây Lúa của IRRI (1996).
Các giai đoạn sinh trưởng của cây lúa được chia thành 9 giai đoạn như sau:
Giai đoạn 1: Nảy mầm Giai đoạn 2: Mạ Giai đoạn 3: Đẻ nhánh Giai đoạn 4: Vươn lóng Giai đoạn 5: Làm đòng Giai đoạn 6: Trỗ bông Giai đoạn 7: Chín sữa Giai đoạn 8: Vào chắc Giai đoạn 9: Chín
Các tính trạng theo dõi và đánh giá gồm:
Các cá thể trong toàn ô thí nghiệm được thực hiện qua quan sát bằng mắt, trên từng cây và bộ phận của cây và cho điểm. Các chỉ tiêu được đo đếm, so sánh với đối chứng để đánh giá.
+ Đột biến về thời gian sinh trưởng:
biến chín cực ngắn ngày hoặc chín trung, dài ngày và khóm chín tương đương với đối chứng gọi là thể đột biến ngắn ngày sau đó tính tần số đột biến.
+ Đột biến về hình thái:
Các chỉ tiêu theo dõi và đánh giá bằng phương pháp quan sát trong quần thể phát hiện ra các cá thể có xuất hiện đột biến, thu lại và tiến hành đo đếm.
+ Chiều cao cây: Cây cao hơn hay thấp hơn cây cao nhất hoặc thấp nhất của lô đối chứng từ >20cm là đột biến cao cây hoặc đột biến thấp cây.
+ Độ cứng cây: Được đánh giá lần đầu vào lúc trỗ xong bằng cách lay nhẹ các dảnh, ngược xuôi trong vài lần. Lần quan sát cuối cùng tiến hành vào lúc chín nhằm ghi lại thế đứng của cây.
Giai đoạn sinh trưởng 8 - 9. Thang điểm (số cây đổ): 1. Cứng ;3. Cứng trung bình; 5. Trung bình ;7. Yếu; 9. Rất yếu.
+ Số nhánh đẻ nhiều nhánh: Khóm có số nhánh nhiều hơn khóm có nhiều nhánh nhất của lô đối chứng từ >5 nhánh được coi là đột biến đẻ nhánh khỏe.
+ Số nhánh đẻ từ 1- 2 nhánh: Quan sát và đếm số cây có số nhánh đẻ từ 1- 2 nhánh là đột biến đẻ nhánh ít.
+ Đột biến về các yếu tố cấu thành năng suất: Các chỉ tiêu xác định bằng phương pháp quan sát trong quần thể phát hiện ra các cá thể có xuất hiện đột biến, thu lại và tiến hành đo đếm.
+ Số bông/khóm: Khóm có số bông hữu hiệu nhiều hơn khóm có nhiều bông hữu hiệu nhất của lô đối chứng từ 3 bông trở lên gọi là thể đột biến tăng số bông hữu hiệu nhiều còn số bông hữu hiệu dưới 3 bông gọi là thể đột biến tăng số bông hữu hiệu ít.
+ Số hạt/bông: Bông chính có số hạt/bông nhiều hơn bông chính có số hạt/bông nhiều nhất của lô đối chứng từ 30 hạt trở lên được coi là đột biến tăng số hạt/bông. Bông chính có số hạt/bông ít hơn bông chính có số hạt/bông
ít nhất của lô đối chứng từ 30 hạt trở lên được coi là đột biến giảm số hạt/bông.
+ Trọng lượng 1000 hạt: Cây có trọng lượng 1000 hạt lớn hơn trọng lượng 1000 hạt của đối chứng từ 4gr trở lên được coi là đột biến tăng trọng lượng 1000 hạt, Cây có trọng lượng 1000 hạt ít hơn trọng lượng 1000 hạt của lô đối chứng từ 4gr trở lên được coi là đột biến giảm trọng lượng 1000 hạt
+ Độ thoát cổ bông: Giai đoạn sinh trưởng 7-9.
Thang điểm: 1. Thoát tốt; 3. Thoát trung bình; 5. Vừa đúng cổ bông; 7. Thoát một phần; 9. Không thoát được.
+ Màu vỏ lúa: Giai đoạn sinh trưởng 9.
Thang điểm: 1. Trắng; 2. Hơi nâu; 3. Ánh nâu; 4. Nâu; 5. Đỏ; 6. Tím thay đổi; 7. Tím.
Hương thơm: Giai đoạn sinh trưởng 9.
+ Thang điểm (Vào lúc trỗ hay kiểm tra khi nấu): 0. Không thơm; 1. Hơi thơm; 2. Thơm.
+ Hàm lượng amylose: Sử dụng các phương pháp chuẩn trong phòng thí nghiệm để phân tích hàm lượng amylose, lấy % làm đơn vị tính.
+ Độ phân hủy trong kiềm: Đặt hạt gạo xát vào 10 ml dung dịch 1,7% KOH trong một đĩa chứa nông và sắp xếp làm sao cho các hạt không chạm nhau.
Giai đoạn sinh trưởng 9 (sau khi xay xát).
Thang điểm: 1. Không ảnh hưởng như trở mầu bạc; 2. Trương lên; 3. Trương lên nhưng cổ không hoàn toàn và hẹp; 4. Trương lên và cổ cũng trương hoàn toàn và rộng; 5. Tỏa ra hoặc bị phân đoạn, cổ trương hết và rộng; 6. Tỏa lan và hòa đồng với cổ; 7. Tiêu tan hoàn toàn.
Bảng 2.8. : Các tính trạng nông sinh học và thang điểm
TT Tính trạng
1 Thời gian sinh trưởng (ngày) tính từ khi gieo đến khi có 85% số hạt chín trên các khóm.
Thời gian sinh trưởng (ngày) tính từ khi gieo đến khi có 50% số bông lúa trỗ cộng với thời gian từ khi 50% số bông lúa trỗ đến khi lúa có 80% số hạt chín.
2 Chiều cao cây (cm). Đo từ mặt đất đến đến đỉnh bông dài nhất. Giai đoạn sinh trưởng 8.
3 Số bông/khóm: Đếm tất cả các bông trong 1 khóm. Giai đoạn sinh trưởng 8. 4 Độ cứng cây (giai đoạn sinh trưởng 8-9): 1 - Cứng, 3 - Cứng trung bình, 5 -
Trung bình, 7 - Yếu, 9 - Rất yếu.
5 Độ thoát cổ bông (giai đoạn sinh trưởng 7-9): 1 - Thoát tốt, 3 - Thoát trung bình, 5 - Vừa đúng cổ bông, 7 - Thoát một phần, 9 - Không thoát được.
6 Độ rụng hạt (giai đoạn sinh trưởng 9): 1 - Khó rụng, 5 - Trung bình, 9 - Dễ rụng.
1 Số hạt/bông. 2 Số hạt chắc/bông.
3 Trọng lượng 1000 hạt: Cân 1000 hạt 13% độ ẩm. 4 Chiều dài hạt (mm): Đo từ gốc vỏ mày lên tới mỏ hạt. 5 Chiều rộng hạt (mm): Đo ngang chỗ rộng nhất giữa hai nửa
vỏ trấu.
6 Tỷ lệ dài/rộng hạt.
7 Màu vỏ gạo: 1 - Trắng, 2 - Nâu nhạt, 3 - ánh nâu, 4 - Nâu, 5 - Đỏ, 6 - Tím một phần, 7 - Tím.
8 Năng suất lý thuyết (tạ/ha) = Mật độ x Số bông hữu hiệu/khóm x số hạt chắc/bông x khối lượng 1000 hạt (g) x 1/10000.
theo IRRI, 1996 [21]
Phương pháp nghiên cứu trong phòng thí nghiệm - Dụng cụ, máy móc và thiết bị thí nghiệm:
Cân phân tích, Máy cất nước, Máy khuấy từ, Máy luân nhiệt PCR của hãng, Máy điện di, Máy soi gel, Micropipette, Tủ lạnh.
- Hóa chất: Một số hóa chất thông dụng của các hãng Sigma, Merck,...CTAB, Tris base, Boric acid, NaCl, dNTPs, EDTA, 6X orange loading dye solution, Taq Polymeraza, Ethanol, 2-propanol, Acetic acid glacial, Phenol, Chloroform, isoamyalcohol, NaOH, HCL, KOH,…
Bảng 2.2: Tên và vị trí các mồi trên nhiễm sắc thể
stt Mồi Nhiễm sắc thể Mồi xuôi Mồi ngược
1 RM323 1 CAACGAGCAAATCAGGTCAG GTTTTGATCCTAAGGCTGCTG 2 SalT1add6 1 TACGTGTTGCACCGATCCGT TGCTGAACATGTACAAATGACC 3 RM452 2 CTGATCGAGAGCGTTAAGGG GGGATCAAACCACGTTTCTG 4 RM341 2 CAAGAAACCTCAATCCGAGC CTCCTCCCGATCCCAATC 5 SRWD5 3 TACGTCGGTGAGCCCTGACGG TGCCACGCCGACGAGAACGA
6 RM122 4 GAGTCGATGTAATGTCATCAGTGC GAAGGAGGTATCGCTTTGTTGGAC 7 RM13 5 TCCAACATGGCAAGAGAGAG GGTGGCATTCGATTCCAG
8 xa5add35 5 TAGTGGCATGGAAATATGG TAGGAGAAACTATTCCA
9 M-WX 6 WxF: AGAGGGGGAGAGGAGAGAACG WxtT:CAGGAAGAACATCTGCGAGT WxR: CCTAACCAAACATAACGAAGG 10 BADH2 6 ESP:TTGTTTGGAGGCTTGCTGATG IFAP: CATAGGAGCAGCTGAAATATATACC INSP: CTGGTAAAAAGATTATGGCTTCA
stt Mồi Nhiễm sắc thể Mồi xuôi Mồi ngược EAP: AGTGCTTTACAAAGTCCCGC 11 P3 6 CAGCAATTCACTGGAGTAGTGGTT CATCACGGTCACCGCCATATCGGA 12 RM234 7 ACAGTATCCAAGGCCCTGG CACGTGAGACAAAGACGGAG 13 RM247 7 TAGTGCCGATCGATGTAACG CATATGGTTTTGACAAAGCG 14 RM1 8 GCGAAAACACATGCAAAAA GCGTTGGTTGGACCTGAC 15 RM337 8 GTAGGAAAGGAAGGGCAGAG CGATAGATAGCTAGATGTGGCC 16 RM431 8 TCCTGCGAACTGAAGAGTTG AGAGCAAAACCCTGGTTCAC 17 DREB1A 8 GAGTCTTCGGTTTCCTCAG CCACTTACCGGAGTTTCTC 18 RM225 11 TGCCCATATGGTCTGGATG GAAAGTGGATCAGGAAGGC 19 RM224 11 ATCGATCGATCTTCACGAGG TGCTATAAAAGGCATTCGGG 20 RM160 12 AGCTAGCAGCTATAGCTTAGCTGGAGATCG TCTCATCGCCATGCGAGGCCTC
Phương pháp phân tích thành phần sinh hóa trong gạo. Xác định hàm lượng amylose
Tiến hành theo phương pháp Cagampang DNA Rodriguez (1980) [34]. -Bước 1: Chuẩn bị dung dịch
+ Ethanol 95%. + HCl 30%. + NaOH 1N.
+ Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI). - Bước 2: Chuẩn bị mẫu
+ Cân 50 mg bột gạo đã được nghiền mịn, cho vào ống 50 ml. + Thêm 0,5 ml ethanol 95%, lắc nhẹ cho tan đều.
+ Thêm 9,5 ml NaOH 1N. Đun sôi trong 10 phút và lắc đều. + Để qua đêm ở nhiệt độ phòng.
- Bước 3: Pha loãng và đo mẫu
+ Rút 100 μl dịch trích cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dịch trích bằng 100 μl NaOH 1 N).
+ Thêm nước cất khoảng ½ bình, lắc đều. + Thêm 250 μl HCl 30%, lắc đều.
+ Thêm 250 μl dung dịch Iod, lắc đều. + Thêm nước cất đến vạch định mức.
+ Chuyển sang ống 50 ml, lắc đều và để yên trong 30 phút.
+ Lắc đều trước khi cho vào cuvette. Đo độ hấp thụ ở bước sóng 580 nm. - Bước 4: Dựng đường chuẩn và tính kết quả
+ Đường chuẩn có dạng: Y = aX + b
Trong đó Y: Độ hấp thụ OD
X: Lượng amylose có trong mẫu đem đo (mg/ml). + Tính hàm lượng amylose theo công thức:
2
+ Đánh giá hàm lượng amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988) được trình bày như ở Bảng 3.1.
Bảng 2.3. Hệ thống đánh giá chuẩn hàm lượng amylose cho lúa (IRRI, 1988)
NHÓM Hàm lượng amylose (%) Gạo nếp 0-2 Gạo tẻ: Rất thấp 3-9 Thấp 10-19 Trung bình 20-25 Cao > 25
Xác định độ phân hủy kiềm
Tiến hành theo phương pháp của IRRI (1979)
+ Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống/dòng được thử. Mỗi mẫu lấy sáu hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào đĩa petri.
+ Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi đĩa.
+ Đậy dĩa petri, để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.
+ Đánh giá độ lan rộng và độ trong suốt của hạt gạo theo thang điểm của IRRI (1986) được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 2.4. Bảng phân cấp độ trở hồ (IRRI, 1979)
CẤP Độ lan rộng
1 Hạt gạo còn nguyên. 2 Hạt gạo phồng lên.
3 Hạt gạo phồng lên; viền còn nguyên hay rõ nét. 4 Hạt gạo phồng lên; viền còn nguyên và nở rộng. 5 Hạt rã ra; viền hoàn toàn nở rộng.
6 Hạt tan ra hòa chung với viền.
Cấp trung bình sẽ được tính theo công thức: Σxi x n Cấp trở hồ = N Trong đó: xi : cấp độ trở hồ. n : số hạt có cấp độ trở hồ xi N : số hạt thử nghiệm.
Cấp độ trở hồ được đánh giá theo thang điểm của IRRI (1979) (Bảng 2.5)
Bảng 2.5. Đánh giá độ trở hồ theo thang điểm của IRRI (1979)
CẤP Độ trở hồ 1 - 3 4 - 5 6 - 7 Cao Trung bình Thấp
2.3.1.1. Đánh giá đa dạng di truyền bằng chỉ thị phân tử
Tách chiết DNA tổng số
Mẫu lá non được thu từ cây lúa sau 30 ngày kể từ ngày cấy.
Các bước tiến hành tách chiết DNA
DNA tổng số được tách chiết theo phương pháp của Cheng và cộng sự (2003) [18]. Quy trình tách chiết được tiến hành với các bước như sau:
Bước 1: Nghiền 1,5 - 2 g lá tươi trong nitơ lỏng thành dạng bột mịn bằng chày và cối sứ.
Bước 2: Chuyển bột này sang ống falcon 15ml, sau đó bổ sung 6 ml đệm chiết CTAB (đã được làm nóng đến 65oC).
Bước 3: Ủ mẫu đảo đều và ủ mẫu ở 65oC trong thời gian 60 phút, 10 phút đảo đều một lần.
Bước 4: Làm lạnh đến nhiệt độ phòng. Bổ sung 4 ml Chloroform/Isoamyl alcohol (24:1), đảo đều trong 10 phút. Ly tâm 13000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng.
Bước 5: Chuyển dịch trong phía trên ống falcon sang một ống mới (4ml). Bổ sung một thể tích tương đương (4ml) Isopropanol, đảo đều, giữ ở nhiệt độ - 200C trong 30 phút.
Bước 6: Tủa DNA bằng máy ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 10 phút. Rửa tủa 2 - 3 lần (2 - 3h) mỗi lần với 1 ml Ethanol 70%.
Bước 7: Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 2 ml đệm TE và 15 µl RNase A (10 mg/ml). Ủ ở 37oC trong 3h.
Bước 8: Chuyển dung dịch DNA vào một ống mới. Thêm 2 ml phenol - chloroform - isoamyl alcohol (25:24:1), đảo đều trong 5 - 10 phút và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.
Bước 9: Chuyển phần dịch phía trên vào ống mới. Thêm 750 µl NaCl 5M và 3ml Ete bão hòa hơi nước. Trộn đều và ly tâm 10 phút ở 10000 vòng/phút.
Bước 10: Loại bỏ lớp Ete bên trên. Chuyển phần bên dưới vào ống mới Thêm 3 ml isopropanol, trộn đều và làm lạnh ở -20°C trong 30 phút. Lấy DNA ra bằng đầu pipet hoặc đũa thủy tinh.
Bước 11:Rửa tủa 3 lần với 1.5 ml ethanol 70%.
Bước 12: Làm khô tủa ở nhiệt độ phòng. Thêm 800 µl đệm TE để hòa tan tủa. Giữ dung dịch DNA ở - 20°C.
Đo độ tinh sạch của DNA
Sau khi tách chiết, độ tinh sạch và nồng độ của DNA được đánh giá bằng phương pháp điện di trên agarose 1% trong môi trường đệm TBE 0,5X và dùng DNA nồng độ (50 ng/µl) làm thang chuẩn, trong 30 phút, điện thế 100V. Sau khi chạy điện di, tiến hành nhuộm bản gel bằng thuốc nhuộm ethidium bromide. Việc chụp mẫu và đo nồng độ được thực hiện bằng máy
Molecular imager FX.
Phương pháp PCR với mồi SSR
Phản ứng PCR được tiến hành trên máy Mastercycler – personal và được trình bày trong bảng 2.6:
Bảng 2.6. Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với mồi SSR
Stt Thành phần Thể tích (l)
1 H2O cất khử trùng 8.95
2 Buffer 10X 1,5
3 MgCl2 (50mM) 0,45
4 dNTP (1mM) 1,0
5 Taq DNA polymeraza (5U) 0,1
6 Primer forward 5M 0,5
7 Primer Revert 5M 0,5
8 DNA (35ng/ l) 2,0
Tổng thể tích: 15
hi đã có đủ thành phần, hàm lượng các chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trình nhiệt trong máy PCR như sau:
Bảng 2.7 : Chương trình chạy của phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kỳ
1 94 5 phút 1 2 94 30 giây 35 55* 30 giây 72 45 giây 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi SSR cụ thể.
Phương pháp điện di
Bột Agarose được hòa tan trong dung dịch đệm TBE 0.5X với nồng