Các bước tinh sạch Protein tổng số (mg) Hoạt tính tổng (U) Hoạt tính riêng (U/mg protein) Hiệu suất thu nhận enzyme (%) Độ sạch enzyme (Lần) Dịch ngoại bào 112,00 23,59 0,21 100,00 1,00 Màng 50kDa 97,00 40,80 0,42 86,61 2,00 (NH4)2SO4 80% 49,00 50,96 1,04 43,75 4,94
Kết quả bước đầu thu nhận alginate lyase ngoại bào từ chủng vi khuẩn biển B. velezensis R8BF10 cho thấy dịch ngoại bào có hoạt tính 23,59 U/ml. Dịch chiết ngoại bào đã được thực hiện qua hai bước để bước đầu thu nhận enzyme là sử dụng màng cô đặc 50kDa và tủa bằng muối (NH4)2SO4 80%. Sau giai đoạn tinh sạch ban đầu, hoạt tính enzyme tăng 4,96 lần và hiệu suất thu nhận protein đạt 43,75%. Enzyme này được sử dụng để bước đầu đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố môi trường phản ứng đến hoạt tính enzyme. Enzyme này được đặt tên là BalyA.
3.4.2. Kết quả xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của BalyA
Để đánh giả ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của BalyA, hỗn hợp phản ứng được ủ ở khoảng nhiệt độ từ 25 đến 55ºC. Hoạt tính enzyme được ghi nhận và thể hiện ở hình 3.12.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của BalyA
Kết quả cho thấy enzyme hoạt động tốt nhất ở nhiệt độ 40oC. Trong khoảng nhiệt độ từ 30-35oC, enzyme thể hiện hoạt tính từ 56,8% đến 85,5% so với điểm nhiệt độ tối ưu. Khi tăng nhiệt độ lên 45oC hoạt tính enzyme con 78,5% và chỉ còn 15,5% khi tăng nhiệt độ lên 55oC. Kết quả về nhiệt độ hoạt động tối ưu trong nghiên cứu này tương tự với alginate lyase AlgA từ chủng vi khuẩn Bacillus sp. Alg07 [3] và Vibrio sp. QY 105 [73], Serratia marcescens NJ – 07 [74], Isoptericola halotolerans NJ-05 [75]
3.4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA
Để khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA, khoảng pH từ 5-8 đã được đã được tiến hành, kết quả ảnh hưởng của pH đến hoạt tính BalyA được thể hiện ở Hình 3.13.
0.0 20.0 40.0 60.0 80.0 100.0 120.0 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Hoạ t tính (% ) Nhiệt độ oC
Hình 3.13. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của BalyA
Kết quả cho thấy enzyme hoạt động tốt nhất ở pH 7,0 và duy trì hoạt tính 85% ở pH 8, tại điểm pH 8,5 hoạt tính của lyase chỉ còn 59%. Như vậy BalyA hoạt động trong môi trường từ trung tính đến kiềm yếu. Kết quả này của chúng tôi thu nhận được khá tương đồng với các chủng vi khuẩn biển, hầu như có pH hoạt động ở vùng trung tính hoặc kiềm yếu, trong khi đó, pH hoạt động của alginate lyase từ động vật biển có pH hoạt động ở vùng acid yếu. Với khoảng hoạt động từ pH 6-8 (Hoạt tính thấp nhất là 72%), BalyA có tiềm năng để ứng dụng ở quy mô công nghiệp. Tuy nhiên, cần nghiên cứu sâu hơn về độ bền pH vì ở quy mô lớn, phản ứng thủy phân xảy ra, pH khó duy trì ổn định.
3.4.4. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của BalyA
Kết quả xác định ảnh hưởng của ion kim loại được thể hiện ở Hình 3.14. Kết quả cho thấy các ion kim loại hoạt hóa enzyme gồm Ca2+, Mg2+, Mn2+, Co2+, Ni2+; các ion kim loại ức chế hoạt tính enzyme là Zn2+. Trong đó các ion Ca2+, Mg2+ có khả năng hoạt hóa enzyme mạnh nhất. Kết quả này tương tự với kết quả alginate lyase thu nhận từ các chủng vi khuẩn biển như
Bacillus sp. Alg07 [3] và Vibrio sp. QY 105 [73].
0 20 40 60 80 100 120 4 5 6 7 8 9 Hoạt tính (% ) pH
Hình 3.14. Ảnh hưởng của ion kim loại đến hoạt tính của BalyA
3.4.5. Kết quả khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl đến hoạt tính của enzyme
Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hoạt tính của BalyA
Kết quả xác định ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl được thể hiện ở Hình 3.15. Kết quả cho thấy enzyme hoạt động mạnh nhất ở nồng độ NaCl 250 mM. So với kết quả alginate lyase thu nhận từ các chủng vi khuẩn biển như Bacillus sp. Alg07 nồng độ muối NaCl 200 mM [3] và Vibrio sp. QY 105 NaCl 200 mM [74] thì enzyme thu được từ chủng vi khuẩn biển Bacillus
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Đối chứng Ca2+ Mg2+ Mn2+ Co2+ Ni2+ Zn2+
Hoạt
tính (%
)
Các inon hóa trị II
0 20 40 60 80 100 120 -100 0 100 200 300 400 500 600 Hoạt tính (% ) Nồng độ NaCl (mM) Ca2+ Mg2+ Mn2+ Co2+ Ni2+ Zn2+
velezensis R8BF10 hoạt động mạnh nhất ở nồng muối NaCl cao hơn lên đến 250 mM.
3.4.6. Kết quả xác định khả năng phân cắt alginate của enzyme thu nhận được
Kết quả xác định khả năng phân cắt alginate của enzyme thu được trên cơ chất alginate chiết từ rong S. mcclurei và T. ornata được thể hiện ở hình 3.16. Kết quả cho thấy alginate lyase cắt alginate thành các đoạn có KLPT nhỏ tạo thành các band với kích thước khác nhau trên C-PAGE.
Hình 3.16. Kết quả điện di C- PAGE của alginate chiết từ rong
S. mcclurei, T. ornata và phản ứng giữa alginate và alginate lyase sau 24h phản ứng. (1) S. mcc A, (2) T. o A, (3) T. oA + BalyA, (4) S. mccA + BalyA
Kết quả thu nhận được ở Hình 3.16 cho thấy, khi BalyA phản ứng cắt mạch alginate chiết từ hai loài rong S. mcclurei và T.ornata là khác nhau. Hoạt tính của BalyA trên cơ chất S. mcc A mạnh hơn, tạo thành các band rõ ràng. Điều này có thể giải thích được rằng, chủng vi khuẩn tuyển chọn được phân lập trên môi trường chứa cơ chất đặc hiệu là S. mcc A nên có tính đặc tính xúc tác phù hợp với alginate từ rong S. mcclurei hơn là rong T.ornata. Tuy nhiên, nhận định này cần được xác nhận lại bằng nghiên cứu sâu hơn về tính đặc hiệu cơ chất của enzyme.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
1. Đã phân lập được 47 chủng vi khuẩn biển từ 05 mẫu rong thu được từ vùng biển Khánh Hòa với đặc điểm khuẩn lạc khá đa dạng. Kết quả này đã bổ sung thêm vào bộ sưu tập vi sinh vật biển của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang những chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ rong nâu, tạo cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu khác về sinh vi khuẩn biển.
2. Trong số 47 chủng vi khuẩn biển đã sàng lọc và tuyển chọn được 25 chủng có hoạt tính sinh alginate lyase. Trong đó, có 9 chủng có đường kính vòng phân giải trên 30 mm. Từ đó, đã lựa chọn 3 chủng vi khuẩn để định danh là các chủng R4BF4 được phân lập từ rong S. oligocystum; chủng vi khuẩn R7BF4 được phân lập từ rong S. polycystum; chủng vi khuẩn R8BF10 được phân lập từ rong T. ornata. Kết quả đã cung cấp cơ sở dữ liệu những chủng vi khuẩn tiềm năng sinh alginate lyase, phục vụ cho việc nghiên cứu các enzyme tiềm năng từ vi khuẩn biển.
3. Ba (03) chủng vi khuẩn tuyển chọn được phân loại dựa trên phân tích trình tự gen vùng 16s rDNA bao gồm: B. velezensis R4BF4, Cobetia sp. R7BF4, B. velezensis R8BF10.
4. Alginate lyase từ chủng B. velezensis R8BF10 (BalyA) đã được thu nhận enzyme sơ bộ và thể hiện hoạt tính tốt nhất ở 40oC, pH 7, 10 mM Ca2+ và nồng độ 250 mM NaCl. BalyA có khả năng chuyển hóa alginate chiết từ rong S. mcclurei thành các sản phẩm có KLPT thấp.
Như vậy với các kết quả thu được qua các nội dung nghiên cứu, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra đó là tìm được 25 chủng vi khuẩn biển, định danh được 03 chủng vi khuẩn có nguồn gốc từ rong biển, có khả năng sinh alginate lyase; alginate lyase thu từ chủng vi khuẩn biển B. velezensis R8BF10 có khả năng chuyển hóa alginate chiết xuất từ rong nâu Việt Nam là S. mcclurei và
4.2. KIẾN NGHỊ
Trong tổng số 47 chủng vi khuẩn phân lập được, chỉ mới hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn được ghi nhận. Để có một cơ sở dữ liệu đầy đủ hơn về bộ sưu tập vi sinh vật biển, đề tài xin được kiến nghị bổ sung thêm đặc điểm hình thái của các chủng vi khuẩn này bằng cách quan sát dưới kính hiển vi. Đồng thời có thể định danh tiếp các chủng vi khuẩn biển tiềm năng trong tổng số 25 chủng vi khuẩn biển có hoạt tính.
Việc nghiên cứu tinh sạch enzyme chỉ mới thực hiện ở hai bước là cô đặc và tủa bằng muối ammonium sulfate. Đề tài kiến nghị nghiên cứu sâu hơn việc tinh sạch enzyme qua các bước sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel để thu enzyme có độ tinh khiết cao và hoạt tính mạnh.
Việc xác định đặc tính của enzyme mới chỉ được thực hiện ở bước cơ bản, một số yếu tố khác còn thiếu như ảnh hưởng của nồng độ cơ chất, xác định vận tốc phản ứng, xác định chỉ số Km, xác định các yếu tố ức chế hoạt tính enzyme. Từ đó có thể đưa ra cơ sở rõ ràng trong việc ứng dụng enzyme này để điều chế alginate có khối lượng phân tử thấp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Y. Iwamoto, X. Xu, T. Tamura, T. Oda, T. Muramatsu, 2003, Enzymatically Depolymerized Alginate Oligomers That Cause Cytotoxic Cytokine Production in Human Mononuclear Cells, Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry,67, pp 258-263.
2. K.Y. Lee, D.J. Mooney, 2012, Alginate: Properties and biomedical applications., Progress in Polymer Science, 37, pp 106–126.
3. P. Chen, Y. Zhu, Y. Men, Y. Zeng, Y. Sun, 2018, Purification and characterization of a novel alginate lyase from the marine bacterium
bacillus sp. Alg07, Marine Drugs, 16, 86, pp 1-13.
4. B. Zhu, H. Yin, 2015, Alginate lyase: Review of major sources and classification, properties, structure-function analysis and applications,
Bioengineered, 6, pp 125-31.
5. H. Tavafi, A. Abdi-Ali, P. Ghadam, S. Gharavi, 2017, Screening of alginate Lyase-Producing bacteria and optimization of media compositions for extracellular alginate Lyase production, Iran. Biomed. J,
21, pp 48-56.
6. T.Y. Wong, L.A. Preston, N.L. Schiller, 2000, Alginate Lyase: Review of Major Sources and Enzyme Characteristics, Structure-Function Analysis, Biological Roles, and Applications, Annu. Rev. Microbiol, 54, pp 289– 340.
7. T. Sawabe, R. Tanaka, M.M. Iqbal, K. Tajima, Y. Ezura, E.P. Ivanova, R. Christen, 2000, Assignment of Alteromonas elyakovii KMM 162(T) and five strains isolated from spot-wounded fronds of Laminaria japonica to
Pseudoalteromonas elyakovii comb. nov. and the extended description of the species, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 50, pp 265-271.
8. W. Li, S. Dong, J. Song, C.B. Li, X.L. Chen, B. Bin Xie, Y.Z. Zhang, 2011, Purification and characterization of a bifunctional alginate lyase from Pseudoalteromonas sp. SM0524, Marine Drugs. 9, pp 109-123. 9. L.N.H. Bui Minh Ly, 2020, Potential of Viet Nam seaweed biomass
production for biofuel, in: Hội Nghị Khoa Học Kỷ Niệm 35 Năm Viện Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, pp 1-12.
10.E.C.C. Starford, F.C.S, 1883, Algin: A new substance obtained from some of the commoner species of marine algae, scientific american supplement, No396, pp 6323-6324.
11.Xi Guo, Yan Wang, Yimin Qin, Peili Shen, Qiang Peng, 2020, Structures, properties and application of alginic acid: A review,
international Journal of Biological Macromolecules, 162, pp 618-628. 12.Simranjeet Kaur, 2021, Characterization of alginate lyase and its
immobilization to hydrolyze alginate, Flinders University, College of Medicine and Public Health, , Masters Biotechnology.
13.Hadas Hecht and Simcha Srebnik, 2016, Structural Characterization of Sodium Alginate and Calcium Alginate, Biomacromolecules, 17, pp 2160- 2167.
14.Farhad Abasalizadeh, Sevil Vaghefi Moghaddam, Effat Alizadeh, Elahe akbari, Elmira Kashani, Seyyed Mohammad Bagher Fazljou, Mohammadali Torbati and Abolfazl Akbarzadeh, 2020, Alginate-based hydrogels as drug delivery vehicles in cancer treatment and their applications in wound dressing and 3D bioprinting, Journal of Biological Engineering, 14, pp 1-22.
15.M. Szekalska, A. Puciłowska, E. Szymanska, P. Ciosek, K. Winnicka, 2016, Alginate: Current Use and Future Perspectives in Pharmaceutical and Biomedical Applications, International Journal of Polymer Science
pp 1-17.
16.César Peteiro, 2017, Alginate Production from Marine Macroalgae, with Emphasis on Kelp Farming, In: Rehm B., Moradali M. (eds) Alginates and Their Biomedical Applications. Springer Series in Biomaterials Science and Engineering, 11, pp 27-66.
17.S.N. Pawar, K.J. Edgar, 2012, Alginate derivatization: A review of chemistry, properties and applications, Biomaterials. 33, pp 3279-3305. 18.S. Terakado, M. Ueno, Y. Tamura, N. Toda, M. Yoshinaga, K. Otsuka, A.
alginate oligosaccharides attenuate hypertension and associated kidney damage in Dahl salt-sensitive rats fed a high-salt diet, Clinical and Experimental Hypertension, 34, pp 99-106.
19.N.K. Sachan, S. Pushkar, A. Jha, A. Bhattcharya, 2009, Sodium alginate : the wonder polymer for controlled drug delivery, J. Pharm. Res, 2, pp 1191-1199.
20.K.I. Draget, G. Skjåk Bræk, O. Smidsrod, 1994, Alginic acid gels: the effect of alginate chemical composition and molecular weight,
Carbohydrate Polymer, 25, pp 31–38.
21.Imrana I. Kabir , Charles C. Sorrell , Sajjad S. Mofarah , Wei Yang , Anthony Chun Yin Yuen , Muhammad Tariq Nazir & Guan Heng Yeoh, 2021, Alginate/Polymer-Based Materials for Fire Retardancy: Synthesis, Structure, Properties, and Applications, Polymer Reviews, 61, pp 357-414. 22. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Tuấn Anh, Ngô Đăng Nghĩa,
2004, Chế biến rong biển Việt Nam, nhà xuất bản Nông nghiệp.
23. X. Hu, X. Jiang, J. Gong, H. Hwang, Y. Liu, H. Guan, 2005, Antibacterial activity of lyase-depolymerized products of alginate,
Journal of Applied Phycology, 17, pp 57-56.
24.Saira Khan, Anne Tøndervik, Håvard Sletta, Geir Klinkenberg, Charlotte Emanuel, Edvar Onsøyen, Rolf Myrvold, Robin A. Howe, Timothy R. Walsh, Katja E. Hill and David W. Thomas, 2012, Overcoming Drug Resistance with Alginate Oligosaccharides Able To Potentiate the Action of Selected Antibiotics, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 56, pp 5134-5141.
25.A.P.A. de Sousa, M.R. Torres, C. Pessoa, M.O. de Moraes, F.D.R. Filho, A.P.N.N. Alves, L.V. Costa-Lotufo, 2007, In vivo growth-inhibition of Sarcoma 180 tumor by alginates from brown seaweed Sargassum vulgare,
Carbohydrate Polymers, 69, pp 7-13.
26.I.A. Brownlee, A. Allen, J.P. Pearson, P.W. Dettmar, M.E. Havler, M.R. Atherton, E. Onsøyen, 2005, Alginate as a source of dietary fiber, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 45, pp 497-510.
of soluble sodium alginate on cholesterol excretion and glucose tolerance in rats, Journal of Ethnopharmacology, 54, pp 47-54.
28.Z.H. Kelishomi, B. Goliaei, H. Mahdavi, A. Nikoofar, M. Rahimi, A.A. Moosavi-Movahedi, F. Mamashli, B. Bigdeli, 2016, Antioxidant activity of low molecular weight alginate produced by thermal treatment, Food Chem, 196, pp 897-902.
29.Mikinori Ueno, Tatsuya Oda, 2014, Biological Activities of Alginate,
Advances in Food and Nutrition Research, 72, pp 95 - 112.
30.V. Ho¨llriegl, M. Ro¨hmu, U. Oeh, and P. Roth, 2004, Strontium Biokinetics in Humans: Influence of Alginate on the Uptake of Ingested Strontium. Health Physics,86, pp 193 - 196.
31.Jun Liu , Shaoqing Yang, Xiuting Li, Qiaojuan Yan, Martin J. T. Reaney, and Zhengqiang Jiang, 2019, Alginate Oligosaccharides: Production, Biological Activities, and Potential Applications, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 18, pp 1859-1881.
32.Wenhui Zhu, Defa Li, Jianhong Wang, Hui Wu, Xuan Xia, Wanghua Bi, Huashi Guan, and Liying Zhang, 2015, Effects of polymannuronate on performance, antioxidant capacity, immune status, cecal microflora, and volatile fatty acids in broiler chickens, Poultry Science, 94, pp 345-352. 33.Ken-ichi Iwasaki, Yasuhito Matsubara, 2020, Purification of Alginate
Oligosaccharides with Root Growth-promoting Activity toward Lettuce,
Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 64, pp 1067-1070.
34.Le Quang Luan, Naotsugu Nagasawa, Vo Thi Thu Ha, Nguyen Quoc Hien, Tomoko M. Nakanishi, 2009, Enhancement of plant growth stimulation activity of irradiated alginate by fractionation, Radiation Physics and Chemistry, 78, pp 796–799.
35.Kurt Ingar Draget, Gudmund Skja˚k-Bræk, Olav Smidsrød, 1997, Alginate based new materials, international Journal of Biological Macromolecules, 21, pp 47–55.
36.Tran Van Cuong, Nguyen Thi Thoa, Kim Duwoon, 2018, marine alginate oligosaccharides a promising biomaterial: Current use and future perspectives in food industry and pharmaceutical applications, Vietnam
Journal of Science and Technology, 56, pp 133-147.
37.Z. Zhu, Q. Zhang, L. Chen, S. Ren, P. Xu, Y. Tang, D. Luo, 2010, Higher specificity of the activity of low molecular weight fucoidan for thrombin- induced platelet aggregation, Thrombosis Research, 125, pp 419-426. 38.Liu Ming, Liu Lei, Zhang Hong fu, Yi Bao, Nadia Everaert, 2021,
Alginate oligosaccharides preparation, biological activities and their application in livestock and poultry, Journal of Integrative Agriculture, 20, pp 24-34.
39.Nancy P. Chandía, Betty Matsuhiro, Enrique Mejías & Alejandra Moenne, 2004, Alginic acids in Lessonia vadosa: Partial hydrolysis and elicitor properties of the polymannuronic acid fraction, Journal of Applied Phycology, 16, pp 127–133.
40.Bouissil Soukaina, EL Alaoui-Talibi Zainab, Pierre Guillaume, Rchid Halima, Michaud Philippe, El Modafar Cherkaoui and Delattre Cédric, 2010, Radical Depolymerization of Alginate Extracted from Moroccan Brown Seaweed Bifurcaria bifurcata, Applied Sciences,10, pp 1-12.