2.3.1. Xử lý mẫu
Các mẫu rong nâu được thu ở các địa điểm của vùng biển Khánh Hòa được cho vào các túi zip, mỗi mẫu rong được cho vào mỗi túi và bảo quản ở nhiệt độ 15-200C và vận chuyển về phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập vi khuẩn.
Các mẫu rong nâu sau khi được thu đưa về phòng thí nghiệm sẽ được tiến hành xử lý mẫu ngay trong ngày, các mẫu sẽ được phân loại, chụp hình,
Thu và xử lý các mẫu rong nâu
Phân lập vi khuẩn biển theo định hướng sinh
alginate lyase
Sàng lọc chủng hoạt tính cao để định danh
Lên men, thu nhận, xác định đặc tính xúc tác
Bộ sưu tập vi khuẩn biển nguồn gốc từ rong nâu
Bộ sưu tập vi khuẩn biển sinh alginate lyase
Dữ liệu 16S rDNA
Lên men thu nhận enzyme Ảnh hưởng của nhiệt độ Ảnh hưởng của pH
Ảnh hưởng của ion hóa trị II Ảnh hưởng của NaCl
mã hóa, trích mẫu định danh (Hình 2.2). Phần mẫu còn lại sẽ được sử dụng để phân lập vi khuẩn biển. Mẫu rong được rửa ba lần với nước biển vô trùng để loại bỏ vi sinh vật ngoại nhiễm, sau đó sử dụng cối sứ đã được vô trùng nghiền nát để thu dịch mẫu (xem phụ lục 1 các Hình P 3, Hình P 4).
2.3.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn biển từ rong biển
Phương pháp phân lập vi khuẩn từ các mẫu rong nâu được thực hiện theo phương pháp của Nguyễn Thị Thuận và cộng sự [84]. Sơ đồ nghiên cứu được thể hiện ở sơ đồ Hình 2.3. Cụ thể:
Một gam (g) mẫu được đồng nhất với 10ml nước biển vô trùng. Pha loãng mẫu đến nồng độ thích hợp. Cấy trang 100µl mẫu ở các nồng độ pha loãng 10-5, 10-6, 10-7 dịch lên đĩa thạch chứa môi trường phân lập có bổ sung alginate từ rong S. mcclurei làm nguồn carbon chỉ thị (MBA). Để phân lập vi khuẩn biển đĩa thạch MBA được ủ ở 30oC. Sau 1-5 ngày, khuẩn lạc rời có đặc điểm hình thái khác nhau được cấy chuyển trên môi trường MB (không có chứa alginate) để có khuẩn lạc thuần, đơn lẻ.
Từ các đĩa phân lập, các khuẩn lạc đơn của vi khuẩn lần lượt được kiểm tra độ thuần khiết bằng phương pháp cấy ria ba chiều. Sau khi cấy, lật ngược đĩa thạch lại, bao gói bằng giấy báo và nuôi trong tủ ấm ở 37ºC trong vòng 24 giờ. Kiểm tra độ thuần khiết của giống bằng cách kiểm tra vết cấy. Mỗi khuẩn lạc rời được cấy chuyển ít nhất 3 lần để đảm bảo về độ thuần chủng. Vi khuẩn được gọi là thuần khi các khuẩn lạc trên đĩa tương đồng về hình thái, kích thước, màu sắc. Đặc điểm khuẩn lạc rời trên đĩa được mô tả dựa trên màu sắc, kích thước, hình thái, đặc điểm bề mặt và rìa của khuẩn lạc.
Chủng vi khuẩn thuần chủng được mã hóa và lưu giữ trong môi trường MB lỏng (không có chứa agar) bổ sung 30% glycerol (v/v), giữ ở - 80oC thuộc bộ sưu tập vi sinh vật biển của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.