3.2.5.4. Đánh giá hiệu quả của biện pháp đặt bẫy hấp dẫn đối với sâu tơ - Mục tiêu: xác định hiệu quả kết hợp của pheromone giới tính và hợp chất AITC trong phòng trị sâu tơ.
Nghiên cứu được thực hiện tại hai địa điểm gồm Tp. Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng và huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc trăng.
a. Thí nghiệm 1: đánh giá hiệu quả của pheromone giới tính tổng hợp
kết hợp với allyl isothiocyanate trong việc làm giảm tỷ lệ gây hại sâu tơ tại Tp. Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng
- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ ngày 25/02/2017 đến 22/4/2017.
- Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện trên các ruộng cải bắp của HTX Anh Đào, Phường 6, Tp. Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
- Cách tiến hành: thí nghiệm được thực hiện theo hình thức đánh giá trên diện rộng với 4 nghiệm thức (trial plots) trên 4 ruộng cải bắp (Hình 3.14) ở thời điểm 14 ngày sau khi trồng (Bảng 3.9).
- Ghi nhận chỉ tiêu: các chỉ tiêu được ghi nhận 1 tuần/lần, trong suốt thời gian thí nghiệm như sau:
Lấy mẫu theo QCVN 01 - 169 : 2014/BNNPTNT: Số lượng thành trùng vào bẫy (TT/bẫy/tuần); Mật số sâu (con/cây); Tỷ lệ lá bị hại (%); Diện tích lá bị hại (%); Chỉ số hại (%) (QCVN 01 - 169 : 2014/BNNPTNT (có hiệu chỉnh); Iman et al., 1990).
+ Mật số sâu (MSS) được tính theo công thức: Tổng số sâu điều tra
MSS (con/cây) = --- x 100 Tổng số cây điều tra
53 Tổng số lá bị hại
TLLBH (%) = --- x 100 Tổng số lá quan sát
+ Chỉ số lá bị hại (CSLBH) được tính theo công thức: [(N1x1) + (N3x3) + … (Nnxn)]
CSLBH (%) = --- x 100 Nxn
Trong đó: N1 là lá bị hại ở cấp 1; N3 là lá bị hại ở cấp 3; …Nn là lá bị hại ở cấp n; N là tổng số lá điều tra.
- Cách ghi nhận chỉ tiêu: trên mỗi ruộng thí nghiệm chọn 5 điểm theo hai đường chéo gốc (4 điểm ngoại vi và 1 điểm trung tâm), 3 cây/điểm ghi, tương tự Hình 3.12.
Bảng 3.9. Các nghiệm thức bố trí trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả phòng trị của pheromone giới tính kết hợp với AITC đối với sâu tơ hại cải bắp tại Tp. Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng
Nghiệm thức
Hình thức xử lí
Bẫy (pheromone+AITC) Phun thuốc
1 6 bẫy/500 m2 Không phun thuốc
2 30 bẫy/2.500 m2 Phun 2 lần thuốc
3 700 m2, không đặt bẫy Phun 6 lần thuốc
4 300 m2, không đặt bẫy Không phun thuốc
Ghi chú: Bẫy hấp dẫn (0,01 mg của hỗn hợp Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và Z11-16:OH + 0,7 mg AITC)
Hình 3.14. Các ruộng cải bắp đặt bẫy hấp dẫn để phòng trị sâu tơ ở HTX Anh Đào, Phường 6, TP Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng
54
b. Thí nghiệm 2: tương tự như Thí nghiệm 1, nhưng được thực hiện tại huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng
- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ ngày 6/01/2018 đến 27/02/2018.
- Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện trên các ruộng cải bắp của xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng.
- Cách tiến hành thí nghiệm: tương tự như Thí nghiệm 1, các ruộng thí nghiệm được trình bày trong Bảng 3.10.
- Ghi nhận chỉ tiêu: các chỉ tiêu được ghi nhận 1 tuần/lần, trong suốt thời gian thí nghiệm như sau:
- Cách ghi nhận chỉ tiêu giống Thí nghiệm 1. - Xử lý chỉ tiêu tương tự như trong Thí nghiệm 1.
Bảng 3.10. Các nghiệm thức trong thí nghiệm đánh giá hiệu quả phòng trị của pheromone giới tính kết hợp với AITC đối với sâu tơ hại rau cải tại huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng
Nghiệm thức Hình thức xử lí
Bẫy (pheromone + AITC) Phun thuốc (lần/vụ)
1 9 bẫy/700 m2 Không phun thuốc
2 9 bẫy/700 m2 Phun 2 lần thuốc
3 760 m2, không đặt bẫy Phun 8 lần thuốc
4 140 m2, không đặt bẫy Không phun thuốc Ghi chú: Bẫy Pheromone (5:5:1): 0,01 mg/tuýp + AITC 0,7 mg/tuýp
3.3. Xử lý số liệu
Số liệu thu thập trong thí nghiệm được nhập vào phần mềm Microsoft Office Excel 2010 xử lý thống kê, kiểm định DUNCAN bằng chương trình SPSS 16.0.
- Trung bình số lượng thành trùng vào bẫy, mật số sâu trong các thí nghiệm đều được quy đổi sang log (x+1) trước khi xử lý thống kê (Vang et al.,
2006; Miluch et al., 2014).
- Trung bình tỷ lệ lá bị hại, diện tích lá bị hại và chỉ số hại trong các thí nghiệm đều được quy đổi sang Asinx trước khi xử lý thống kê (Vang et al.,
55
CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Tổng hợp pheromone giới tính của sâu tơ 4.1.1. Khái quát 4.1.1. Khái quát
Sự tổng hợp các thành phần (Z)-11-hexadecen-1-ol (Z11-16:OH), (Z)- 11-hexadecenal (Z11-16:Ald) và (Z)-11-hexadecenyl acetate (Z11-16:OAc) được bắt đầu bằng phản ứng ether hóa để chuyển nhóm OH của hợp chất 11- Bromo-1-undecanol sang methoxymethyl (MOM) ether (2) (hiệu suất phản ứng = 86,6%). Hợp chất (2) sau đó được đun với Triphenylphosphine ở 1000C trong 24 giờ để thu muối phosphorane (3), rồi kết hợp với Pentanal thông qua phản ứng Wittig dưới tác động bazơ của Sodium bis(trimethylsilyl)amide trong THF để tạo thành MOM ether của hợp (Z)-11-hexadecen-1-ol MOM ether (4) (hiệu suất phản ứng = 69,7%). Sau khi loại bỏ sự bảo vệ nhóm chức OH của MOM ether bằng cách khuấy (4) trong dung dịch 0,5N HCl trong methanol, hợp chất Z11-16:OH thu được với hiệu suất phản ứng 70,8% (hiệu suất phản ứng tổng 42,9% tính từ chất phản ứng ban đầu). Hợp chất Z11- 16:OH thu được oxy hóa bằng phản ứng oxy hóa bằng PCC hoặc acetyl hóa bằng acetic anhydride tạo thành các hợp chất Z11-16:Ald (hiệu suất phản ứng 90,4%) và Z11-16:OAc (hiệu suất phản ứng 71,4%).
Br OH a Br OMOM b BrPh3 OMOM c OMOM d OH H O e O O Z11-16:OH Z11-16:Ald Z11-16:OAc f
Hình 4.1. Sơ đồ quy trình tổng hợp các hợp chất Z11-16:OH, Z11-16:Ald và Z11-16:OAc 16:OAc
a = DMM/LiBr/p-TsOH; b = PPh3/1000C; c = 1) NaN(SiMe3)2/THF,
2) pentanal/THF; d = 0.5N HCl/MeOH; e = PCC/CH2Cl2; f = acetic anhydride /pyridine
4.1.2. Quy trình tổng hợp 4.1.2.1. (Z)-11-Hexadecen-1-ol 4.1.2.1. (Z)-11-Hexadecen-1-ol
56
Hỗn hợp của 11-Bromo-1-undecanol (3 g, 11,9 mmol), LiBr (1,38 g) và P-TsOH (190mg) được khuấy trong 60 ml Dimethoxymethyl (DMM) ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau khi kiểm tra điểm kết thúc phản ứng bằng TLC (Rf = 0,08; 6 Bz: 4 EtOAc) hỗn hợp được chuyển vào phễu ly trích và lắc với 100 ml nước và n-hexane, tách lấy phần dung môi hữu cơ. Phần dung dịch nước còn lại được trích với n-hexane (100 ml x 3 lần). Lượng n-hexane ly trích được kết hợp với phần dung môi hữu cơ, lọc qua Na2SO4, cô đặc và làm tinh khiết bằng cột sắc ký mở, sử dụng silica gel làm pha tĩnh thu được hợp chất 1- Bromo-11-methoxymethoxy-undecane (2) (3,03 g; 10,2 mmol), đạt hiệu suất phản ứng 86,6%.
Hình 4.2. Biểu đồ sắc ký tổng ion (trên) và phổ khối lượng của hợp chất 1-Bromo-11-methoxymethoxy-undecane (dưới) 11-methoxymethoxy-undecane (dưới)
- Dữ liệu GC-MS: thời gian lưu (retention time, Rt) là 31,37 phút; Phổ khối lượng (m/z): 45 (base), 55, 61, 69, 83, 95, 109, 123, 232 và 295.
RT:0.00 - 57.26 SM:15B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 31.27 32.05 29.32 33.55 38.02 39.80 2.91 42.15 4.01 4.25 45.29 49.51 24.76 55.93 22.87 7.01 14.32 20.57 NL: 1.58E9 TIC MS SPB1
57 - Dữ liệu NMR: phổ 1H NMR (ppm): 1.28 (14H, broand), 1,54-1,64 (2H, tt, J = 6,88, 6,67 Hz), 1,80-1,90 (2H, tt, J = 7,13, 7,18 Hz), 3,34 (3H, s), 3,37-3.41 (2H, t, J=6.88 Hz), 3.48-3.53 (2H, t, J=6.63 Hz) và 4.61 (2H, s), phổ 13C NMR (ppm): 26,18, 28,14, 28,72, 29,38, 29,39, 29,43, 29,51, 29,71, 32,81, 34,01, 55,06, 67,84, 76,61, 77,03, 77,45 và 96,35.
b) Hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol MOM ether (4)
Hỗn hợp của 1-Bromo-11-methoxymethoxy-undecane (2) (3,03 g; 10,3 mmol) và triphenylphosphine (3,42 g; 13 mmol) được khuấy trong một bình cầu ở nhiệt độ 1000C cho đến khi tạo thành dạng sệt (3) như keo (khoảng 24 giờ). Sau khi để nguội về nhiệt độ phòng, bình cầu được thêm vào 50 ml THF và 12 ml sodium bis(trimethylsilyl)amide trong THF (nhỏ từng giọt). Đợi cho hỗn hợp trong bình hòa tan hoàn toàn (có màu đỏ cam), Pentanal (1,0 g; 11,6 mmol) được cho từng giọt vào bình, khuấy thêm khoảng 1 giờ, thêm vào 100 ml nước lạnh, rồi chuyển vào phễu phân tách để tách lấy phần hữu cơ. Phần nước còn lại trong phễu được ly trích tiếp với 100 ml n-hexane (3 lần). Phần hữu cơ được cô đặc và tinh lọc bằng cột sắc ký mở với silica gel làm pha tĩnh thu được 2,04 g (7,2 mmol) MOM ether của hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol MOM ether (4), đạt 69,7% hiệu suất phản ứng từ (3).
- Dữ liệu GC-MS: Rt: 32,09 phút; MS (m/z): 45 (base), 55, 61, 69, 81, 95, 109, 223, 252 và 284.
58
Hình 4.3. Biểu đồ sắc ký tổng ion (trên) và phổ khối lượng của hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol MOM ether (dưới) hexadecen-1-ol MOM ether (dưới)
c) Hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol
Khuấy hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol MOM ether (4) (2,04 g; 7,2 mmol) trong dung dịch 0,5N HCl trong methanol (50 ml) ở điều kiện nhiệt độ phòng trong 24 giờ. Sau đó, 100ml nước lạnh được thêm vào và hỗn hợp được chuyển sang phễu phân tách để tách lấy phần hữu cơ. Phần hữu cơ được rửa bằng 60 ml dung dịch nước NaHCO3 bão hòa. Phần nước được ly trích tiếp tục bằng 60 ml n-hexane (3 lần). Phần hữu cơ và n-hexane được trộn lại với nhau, lọc qua Na2SO4 thu được hợp chất MOM ether của hợp chất (Z)-11- hexadecen-1-ol đạt hiệu suất phản ứng là 70,8% (1,22 g; 5,1 mmol). Hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol được tinh lọc bằng cột sắc ký mở sử dụng Silica gel làm pha tĩnh. Độ tinh khiết đồng phân của sản phẩm đạt >96% được xác định nhờ kỹ thuật GC-MS. RT:0.00 - 57.27 SM:15B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 32.13 30.41 26.46 33.99 39.93 54.97 39.10 28.38 24.67 35.63 40.28 24.38 48.73 21.62 20.56 2.70 53.04 40.56 4.86 8.30 43.81 49.04 13.30 14.15 NL: 1.93E9 TIC MS SP2
59 - Dữ liệu GC-MS: Rt: 30,65 phút; MS (m/z): 55 (base), 69, 81, 96, 109, 124, 138, 166, 222 & 240. - Dữ liệu NMR: phổ 1H NMR (ppm): 0,86-0,91 (3H, t, J=7.05 HZ), 1,30-1,37 (22H, broad), 1,54-1,63 (2H, tt, J=6,71 Hz, 6,92 Hz), 2,0 (1H, s), 3,60-3,65 (2H, t, J=6,62 Hz) và 5,29-5,39 (2H, m). Phổ 13C NMR (ppm): 14,0, 22,34, 25,73, 26,91, 27,18, 29,29, 29,43, 29,52, 29,55, 29,60, 29,76, 31,95, 32,78, 63,05, 129,86 và 129,88.
Hình 4.4. Biểu đồ sắc ký tổng ion (trên) và phổ khối lượng của hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol (dưới) hexadecen-1-ol (dưới)
4.1.2.2. (Z)-11-hexadecenal
Hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol (500 mg; 2,1 mmol), PCC (679 mg; 3,15 mmol) và 50 ml CH2Cl2 được khuấy ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ. Sau đó, bình phản ứng được kết nối với hệ thống cô-quay để bay hơi toàn bộ dung môi CH2Cl2. Hỗn hợp còn lại được thêm vào 50 ml n-hexane và 50 ml nước rồi chuyển vào phễu phân tách lắc và tách lấy hữu cơ. Phần nước còn trong
60
phễu được ly trích tiếp tục với n-hexane (50 ml x 3 lần). Kết hợp dung môi ly trích với phần hữu cơ, rửa với dung dịch nước bão hòa NaHCO3, cô đặc và làm tinh lọc bằng cột sắc ký mở, sử dụng silica gel làm pha tĩnh, thu được hợp chất (Z)-11-hexadecenal (453 mg; 1,9 mmol), đạt hiệu suất phản ứng là 90,5%.
Hình 4.5. Biểu đồ sắc ký tổng ion (trên) và phổ khối lượng của hợp chất (Z)-11- hexadecenal (dưới) - Dữ liệu GC-MS: Rt 31,83 phút, MS (m/z): 55 (base), 69, 83, 97, 98, 111, 123, 137, 192, 136, 218 và 236. - Dữ liệu NMR: phổ 1H NMR (ppm): 0,86-0,91 (3H, t, J=6,92 HZ), 1,28-1,31 (22H, broad), 1,58-1,64 (2H, tt, J=7.31 Hz, 7,52 Hz), 2,39-2,44 (2H, td, J=7,35 Hz, 1,85 Hz), 5,29-5,39 (2H, m) và 9,75-9,76 (1H, t, J=1,63 Hz). RT:0.00 - 57.28 SM:15B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 31.84 31.52 33.54 34.30 28.91 27.98 35.13 27.49 36.61 4.10 4.26 39.79 42.13 24.75 6.05 8.04 9.31 20.33 22.95 45.26 49.49 55.16 NL: 1.16E9 TIC MS Sample2K NN30-05- 2017
61
Phổ 13C NMR (ppm): 14, 22,07, 22,34, 26,90, 27,16, 29,15, 29,25, 29,34, 29,39, 29,45, 29,73, 31,95, 43,91, 129,83, 129,89 và 203,04.
4.1.2.3. (Z)-11-hexadecenyl acetate
Hợp chất (Z)-11-hexadecen-1-ol (500 mg; 2,1 mmol) được khuấy cùng với anhydride acetic (3,0 ml) trong pyridine (15 ml) ở nhiệt độ phòng trong 3 giờ. Sau đó, bình phản ứng được thêm vào 50 ml n-hexane và 50 ml nước rồi chuyển hỗn hợp sang phễu phân tách, lắc đều, tách lấy phần hữu cơ. Phần nước được ly trích tiếp tục với n-hexane (5 ml x 3 lần). Kết hợp dung môi ly trích với phần hữu cơ, rửa lần lượt với nước lạnh (100 ml), dung dịch HCl 1N (100 ml) và dung dịch bão hòa NaHCO3 (100 ml), cô đặc và tinh lọc bằng cột sắc ký mở sử dụng silica gel làm pha tĩnh thu được hợp chất (Z)-11- hexadecenyl acetate (415 mg; 1,47 mmol), đạt hiệu suất phản ứng là 71,4%.
- Dữ liệu GC-MS: Rt: 31,64 phút; MS (m/z): 55, 61, 67, 81 (base), 96, 110, 124, 138, 166, 194, 222 và 282. - Dữ liệu NMR: phổ 1H NMR (ppm): 0,86-0,90 (3H, t, J=6.93 HZ), 1,26-1,34 (22H, broad), 1,56-1,67 (2H, tt, J=6,27 Hz, 6,8 Hz), 2,0 (3H, s), 4,02-4,07 (2H, t, J=6,8 Hz) và 5,31-5,44 (2H, m). Phổ 13C NMR (ppm): 13,95, 21,01, 22,12, 22,17, 25,90, 28,59, 29,12, 29,25, 29,47, 29,49, 29,52, 29,63, 31,82, 32,27, 32,60, 64,67, 130,30, 130,32 và 171,28.
Bằng con đường tổng hợp sử dụng phản ứng Wittig chọn lọc làm phản ứng chính đã thành công trong việc tổng hợp Z11-16:OH được trình bày trong Hình 4.1. Tổng hiệu suất phản ứng tính từ chất phản ứng ban đầu đạt được là 42,9%. Độ tinh khiết đồng phân của sản phẩm đạt >96% (kiểm tra bằng GC- MS). Hợp chất Z11-16:OH đã được tổng hợp bằng nối acetylen (Tamaki & Kawasaki, 1977) hoặc phản ứng Wittig (Hao et al., 1996; Zong et al., 2011). Trong khi, con đường tổng hợp cũng sử dụng phản ứng Wittig, đã sử dụng hợp chất 11-Bromo-1-undecanol là sản phẩm thương mại làm hợp chất phản ứng ban đầu và phương pháp bảo vệ nhóm chức OH với MOM ether, vì thế đã rút ngắn được con đường tổng hợp (chỉ cần 4 bước để tạo thành hợp chất Z11- 16:OH). Thêm vào đó, việc sử dụng hợp chất sodium bis(trimethylsilyl)amide làm xúc tác (tạo môi trường kiềm) cho phản ứng Wittig giúp cho sản phẩm tạo thành chỉ là đồng phân Z. Điều này làm tăng hiệu suất tổng hợp, đồng thời giảm được công đoạn tách lọc đồng phân E ra khỏi mẫu.
62
Hình 4.6. Biểu đồ sắc ký tổng ion (trên) và phổ khối lượng của hợp chất (Z)-11- hexadecenyl acetate (dưới)
4.2. Đánh giá hiệu quả hấp dẫn của pheromone tổng hợp đối với sâu tơ 4.2.1. Ảnh hưởng của thành phần pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ
Kết quả tổng hợp hóa học của Pheromone giới tính ở Mục 4.1 bao gồm các hợp chất Z11-16:Ald, Z11-116:OAc và Z11-16:OH được điều chế thành mồi và dùng đánh giá hiệu quả hấp dẫn ở ngoài đồng.
Từ Bảng 4.1 cho thấy hiệu quả hấp dẫn của thành phần pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ.
Số lượng thành trùng đực sâu tơ bị bắt trong tất cả các bẫy từ A-1 đến A-7 (Sóc Trăng, từ 3 - 52,8 TT/bẫy/tuần; Vĩnh Long, từ 6,1 - 119,9 TT/bẫy/tuần) cao hơn đáng kể và khác biệt ý nghĩa với mồi bằng ống cao su chỉ nhồi 5µl n-hexane (A-9; đối chứng âm). Kết quả này khẳng định rằng các
RT:0.00 - 57.26 SM:15B 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Time (min) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 32.73 30.88 33.04 29.48 34.03 37.93 38.87 4.00 26.52 22.83 4.836.99 14.25 20.47 44.33 46.1649.47 56.59 NL: 2.28E9 TIC MS Sample3K NN31-05- 2017
63
hợp chất pheromone giới tính tổng hợp có hiệu quả hấp dẫn đối với thành trùng đực sâu tơ ở điều kiện ngoài đồng.
Trong đó, chỉ có mồi gồm 3 thành phần Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và
Z11-15:OH với tỷ lệ 5:5:1 (A-7) cho hiệu quả hấp dẫn thành trùng sâu tơ mạnh nhất (Sóc Trăng, 52,8 TT/bẫy/tuần; Vĩnh Long, 119,9 TT/bẫy/tuần), không khác biệt ý nghĩa thống kê với mồi là thành trùng cái chưa bắt cặp (A- 8) (Sóc Trăng, 96,2 TT/bẫy/tuần; Vĩnh Long, 194,6 TT/bẫy/tuần). Bên cạnh đó, mồi chứa 2 thành phần Z11-16:Ald và Z16-11:OAc, tỷ lệ 5:5 (A-4), cho hiệu quả bắt giữ thành trùng đực sâu tơ (Sóc Trăng, 35,7 TT/bẫy/tuần; Vĩnh Long, 73,1 TT/bẫy/tuần) thấp hơn A-8, nhưng không khác biệt ý nghĩa thống kê so với A-7 và cao hơn có ý nghĩa thống kê so với các mồi chỉ gồm một