3.1.1. Thời gian
Thời gian tiến hành luận án được thực hiện từ năm 2015 đến 2019.
3.1.2. Địa điểm
- Các thí nghiệm trong phòng thí nghiệm được thực hiện tại:
+ Phòng thí nghiệm Phòng trừ Sinh học Côn trùng, Bộ môn BVTV, khoa Nông Nghiệp trường Đại học Cần Thơ – Thực hiện các bước trong quy trình tổng hợp, điều chế mồi và nhân nuôi nguồn thành trùng sâu tơ.
+ Phòng thí nghiệm, Bộ môn Hóa, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ – Thẩm định cấu trúc hóa học bằng kỹ thuật sắc ký khí khối phổ và phân tích phổ hồng ngoại.
+ Phòng thí nghiệm Hóa chất sinh thái, trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo – Gởi mẫu phân tích Cộng hưởng từ hạt nhân.
- Các thí nghiệm ngoài đồng được tiến hành trên các ruộng trồng rau cải của hộ nông dân tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng; xã Thành Lợi, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long và Phường 6, Tp. Đà Lạt, tỉnh Lâm Đồng.
3.1.3. Vật liệu 3.1.3.1. Thiết bị 3.1.3.1. Thiết bị
Tủ sấy; Hệ thống máy cô quay (Rotary evaporator RE300; waterbath RE300B; JSR Ref. bath); Máy khuấy từ gia nhiệt; Máy Sắc ký - Khối phổ (Gas chromatography–Mass spectrometry); Quang phổ hồng ngoại (Infrared spectrometry); Máy cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance); Tủ lạnh;
Lọ thủy tinh màu nâu có nắp đậy (thể tích 4 ml); Micro syringe (dung tích 100 μl, 25 μl); Paster pipett; Bình cầu thủy tinh; Phiễu ly trích; Cột sắt ký mở; Bình tam giác; Beaker thủy tinh.
3.1.3.2. Dụng cụ
Tấm sắc ký (Chromatography paper) lớp mỏng 0,25mm silica gel (silica gel plate) (Merk, Đức);
37
Hộp nhựa tròn (đường kính 10 cm, chiều cao 8 cm); Hộp plastic (đường kính 4 cm, chiều cao 3,5 cm) có nắp đậy;
Rổ lọc trà bằng lưới inox hình bán cầu (đường kính 6cm, cao 3cm) và một số vật liệu hỗ trợ cần thiết khác như máy ảnh, cân điện tử, giấy nhôm, tập, viết, thước, dây ni lông;
Bẫy hấp dẫn là dạng bẫy dính có mái che (30 x 27 cm, Takeda Chemical Ind. Ltd.Osaka, Nhật Bản) và tuýp cao su non (đường kính 0,3 cm, dài 1,5 cm, dùng để ghép cây cà chua non).
3.1.3.3. Hóa chất
a. Hóa chất dùng trong phản ứng
11-Bromo-1-undecanol [Br(CH2)11OH]; Pyridinium chlorochromate [PCC, C5H5NH(CrO3Cl)]; Pentanal (C5H10O); Dimethoxymethane (DMM, C3H8O2); Lithium bromide (LiBr); p-tolunenesulfonic acid monohydrate (p- TsOH, CH3C6H4SO3H.H2O); Triphenylphosphine (PPh3, C18H15P); Sodiumsulfate (Na2SO4); n-butyl Lithium (n-BuLi, solution 1.6M in n-hexane) và silica gel.
b. Dung môi
Benzen (C6H6); n-hexane (C6H14); Ethyl acetate (C4H8O2); Tetrahydrofuran (THF, (CH2)4O); Methylene chloride (CH2Cl2); Axit clohydric (HCl);Natri bicarbonat (NaHCO3) và Pyridine (C5H5N).
c. Mồi pheromone giới tính và kairomone Mồi pheromone giới tính tổng hợp
Các thành phần Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và Z11-16:OH được tổng hợp bởi Chi & Vang (2018) tại phòng thí nghiệm Phòng trừ sinh học Côn trùng, Bộ môn BVTV, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ.
Mồi kairomone
Hợp chất bay hơi Allyl isothiocyanate (AITC) và cis -3-hexenyl acetate (Z3- 6:OAc) là sản phẩm được mua từ Công ty Aldrich (Mỹ) với độ tinh khiết trên 99%.
A B C
38
3.1.3.4. Nguồn thành trùng sâu tơ
Ấu trùng sâu tơ được thu thập từ các ruộng trồng rau cải họ thập tự (huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng và huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long) rồi chuyển về phòng thí nghiệm Phòng trừ Sinh học Côn trùng, Bộ môn BVTV, khoa Nông nghiệp, trường Đại Học Cần Thơ.
Trong phòng thí nghiệm, ấu trùng sâu tơ được nuôi trong hộp nhựa có kích thước 12 cm x 10 cm x 7 cm, được cung cấp lá cải xanh tươi làm nguồn thức ăn đến khi sâu hóa nhộng. Mỗi nhộng được tách ra nuôi riêng trong từng hộp nhựa nhỏ (4 cm x 2,5 cm x 3,5 cm) bên trong có đặt miếng bông gòn ướt để tạo ẩm. Thành trùng sau khi vũ hóa được phân biệt đực, cái (Huỳnh & Sen, 2003) và nuôi thành trùng bằng dung dịch đường sucrose 10% (Vang et al.,2006; Li et al., 2012; Dai et al., 2008)
3.1.3.5. Điều chế mồi
a. Mồi là thành phần hóa học
Các hợp chất Z11-16:OH, Z11-16:Ald, Z11-16:OAc, AITC và Z3- 6:OAc được pha loãng trong n-hexane tinh khiết ở hàm lượng 10mg/ml. Dùng microsyringe hút lấy một lượng tương ứng bơm nhẹ lên thành bên trong của tuýp cao su non. Sau đó để yên 10 phút (cho dung môi bay hơi), tuýp cao su được gói lại bằng giấy nhôm, dán nhãn và trữ trong ngăn mát của tủ lạnh cho đến khi tiến hành thí nghiệm ngoài đồng (Hình 3.3).
A B C D
♀ ♂
E
Hình 3.2 Quy trình thu thập và nhân nuôi thành trùng sâu tơ
(A) Sâu; (B) Hộp nhựa nuôi sâu; (C) Nhộng; (D) Hộp plastic để nuôi riêng nhộng và thành trùng; (E) thành trùng cái và đực
Hình 3.3. Sơ đồ điều chế mồi hấp dẫn đối với sâu tơ bằng pheromone giới tính và các hợp chất hữu cơ bay hơi các hợp chất hữu cơ bay hơi
39
b. Mồi là thành trùng
Thành trùng sâu tơ cái vũ hóa một ngày (chưa bắt cặp) được thả vào bên trong rổ lượt trà bằng lưới inox bên trong có treo một miếng bông gòn tẩm nước đường 10%. Rổ được đậy bằng một tấm bìa cứng và đặt vào giữa tấm dính của bẫy với phần mặt cầu của rỗ hướng lên trên (Hình 3.4.) Mồi chỉ được chuẩn bị vào buổi chiều ở thời điểm ngay trước khi treo bẫy trên ruộng thí nghiệm. Thành trùng trong bẫy và miếng bông gòn tẩm nước đường 10%, thành trùng trong bẫy được thay mới 3 - 4 ngày/lần vào lúc chiều mát (Reddy & Urs, 1997).
Hình 3.4. Sơ đồ điều chế mồi hấp dẫn đối với sâu tơ bằng thành trùng cái
c. Mồi là dịch nghiền cải
Lá cải bắp trưởng thành được rửa sạch, để ráo nước, cắt nhỏ, trộn đều. Trên ruộng thí nghiệm 50 g lá cải được cho vào cối sứ giả nhuyễn cùng với 5 ml
n-hexane. Dùng ống nhỏ giọt hút 1,0 ml dịch lá cải nghiền cho vào mỗi miếng bông gòn được đặt trên miếng bìa cứng (1,5 cm x 2 cm) ở giữa tấm dính của bẫy (Hình 3.5). Mồi được thay mới 3 – 4 ngày/lần, cùng thời điểm với việc thay mới thành trùng cái trong bẫy (Đém & Vàng, 2014).
Hình 3.5. Sơ đồ điều chế mồi hấp dẫn đối với sâu tơ bằng dung dịch lá cải bắp
3.1.3.6. Đặt bẫy hấp dẫn trên ruộng thí nghiệm
Trên ruộng thí nghiệm, mồi được đặt lên giữa tấm dính và lồng vào mái che của bẫy. Dùng 2 thanh tre dài cắm chéo nhau trên mặt ruộng để treo bẫy ở độ cao cách mặt ruộng khoảng 0,5 m (Miluch et al., 2014) (Hình 3.6). Bẫy được đặt trên ruộng ở mật độ 12 bẫy/1.000 m2 (tương ứng khoảng 1 bẫy/80 m2) (Reddy & Urs, 1997).
40
Hình 3.6. Bẫy hấp dẫn được treo trên cải bắp thí nghiệm. Độ cao của bẫy (A); Khoảng cách giữa các bẫy (B) Khoảng cách giữa các bẫy (B)
3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Đề tài ứng dụng hóa chất tín hiệu nhằm góp phần thay thế thuốc bảo vệ thực vật để quản lý sâu tơ P. xylostella hại rau cải ở điều kiện ngoài đồng.
Tổng hợp pheromone giới tính sâu tơ AITC Z3-6:OAc 1. Ảnh hưởng của thành phần pheromone giới tính tổng hợp Đánh giá hiệu quả của hợp chất
(AITC)
Đánh giá hiệu quả của hợp chất
(Z3-6:OAc)
Đánh giá hiệu quả hấp dẫn phối hợp của pheromone giới tính và kairomone đối với sâu tơ
Đánh giá hiệu quả của biện pháp đặt bẫy hấp dẫn đối với sâu tơ 1. Khảo sát thời gian hoạt động của
thành trùng sâu tơ
2. Khảo sát sự biến động mật số quần thể sâu tơ trong năm
3. Khảo sát sự biến động mật số quần thể và tỷ lệ rau cải bị hại do sâu tơ trong một vụ cải
2. Ảnh hưởng của hàm lượng thành phần Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn
3. Ảnh hưởng của hàm lượng mồi lên hiệu quả hấp dẫn
Kairomone
(thương mại)
41
3.2.1.Tổng hợp pheromone giới tính của sâu tơ
Mục tiêu: Tổng hợp các thành phần pheromone giới tính sâu tơ để sử dụng làm nguồn vật liệu cho các nghiên cứu trong điều kiện ngoài đồng.
a) Quy trình tổng hợp
Các hợp chất Z11-16:OH, Z11-16:Ald và Z11-16:OAc tổng hợp bằng con đường sử dụng phản ứng Wittig chọn lọc (selective Wittig reaction) làm phản ứng chính (key reaction) đã được mô tả bởi Vang et al. (2008). Quy trình thực hiện được trình bày ở Hình 3.8.
Sau khi bảo vệ nhóm hydroxyl (OH) của hợp chất 11-Bromo-1- undecanol (1) bằng methoxymethyl (MOM) ether. Hợp chất Bromo ether (2)
sau đó được đun với Triphenylphosphine ở 1000C trong 24 giờ để thu được muối phosphonium (3). Muối (3) được chuyển sang hình thức ylide bằng cách khuấy với Sodium bis(trimethylsilyl)amide [NaN(SiMe3)2] trong dung môi THF, sau đó kết hợp với hợp chất Pentanal để tạo thành MOM ether của hợp chất Z11-16:OH (4). Sự bảo vệ nhóm chức của MOM ether được loại bỏ bằng cách khuấy (4) trong dung dịch 0,5N HCl trong methanol để thu được hợp chất Z11-16:OH. Oxy hóa và acetyl hóa hợp chất Z11-16:OH lần lượt bằng chất oxy hóa PCC và acetic anhydride [(CH3CO)2O)] thu được các hợp chất
Z11-16:Ald và Z11-16:OAc. Br OH Br OMOM a b BrPh3 OMOM c OMOM d OH H O e O O Z11-16:OH Z11-16:Ald Z11-16:OAc f
Hình 3.8.Sơ đồ biễu diễn quy trình tổng hợp các hợp chất Z11-16:OH, Z11-16:Ald và Z11-16:OAc và Z11-16:OAc
a = DMM/LiBr/p-TsOH; b = PPh3/1000C; c = 1) NaN(SiMe3)2/THF,
42
Điểm kết thúc ở mỗi phản ứng được xác định bằng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography, TLC).
Phản ứng chỉ kết thúc khi trong mẫu không còn sự hiện diện của chất phản ứng ban đầu (không có đốm hiện diện của chất phản ứng ban đầu trên đường di chuyển theo dung môi của mẫu như ở Hình 3.10.
Hình 3.10. Các khoảng cách di chuyển của mẫu và dung môiHiệu suất phản ứng (HSPƯ) được tính theo công thức: Hiệu suất phản ứng (HSPƯ) được tính theo công thức: Số mol của sản phẩm
HSPƯ (%) = --- x 100 Số mol của chất phản ứng
b) Thẩm định cấu trúc hóa học của mẫu tổng hợp
Mẫu tổng hợp ở mỗi giai đoạn của quy trình sau khi tinh lọc sẽ được thẩm định cấu trúc hóa học bằng kỹ thuật Sắc ký khí - Khối phổ (Gas chromatography - Mass spectrometry, GC - MS) và phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (Infrared - IR) (tại khoa Khoa học, trường Đại học Cần Thơ). Đồng thời, mẫu cũng được gởi đến Phòng thí nghiệm Hóa chất sinh thái,
Điểm của chất phản ứng Điểm chất chuẩn ban đầu 2cm 10 cm Hình 3.9. Kỹ thuật sắc ký lớp mỏng
43
trường Đại học Nông nghiệp và Công nghệ Tokyo để phân tích Cộng hưởng từ hạt nhân (NMR).
Hình 3.11. Hệ thống GC-MS dùng để đo phổi khối lượng của mẫu
3.2.2. Đánh giá hiệu quả hấp dẫn của pheromone tổng hợp đối với sâu tơ 3.2.2.1. Ảnh hưởng của thành phần pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ
- Mục tiêu: xác định ảnh hưởng của thành phần điều chế lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính đối với sâu tơ.
- Sự đánh giá được tiến hành ở hai địa điểm gồm:
+ Địa điểm 1 được thực hiện tại ruộng cải bắp, thời điểm 60 ngày sau khi trồng, có diện tích 4.000 m2 tại xã Thành Lợi, huyện Bình Tân, tỉnh Vĩnh Long tiến hành từ ngày 17/7/2016 đến 14/8/2016.
+ Địa điểm 2 được thực hiện tại ruộng cải bắp ở thời điểm 50 ngày sau khi trồng, có diện tích 2.500 m2 tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng tiến hành từ ngày 9/9/2016 đến 11/10/2016.
- Cách tiến hành:thí nghiệm được bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 9 nghiệm thức và 3 lần lặp lại (Bảng 3.1). Mỗi lần lặp lại của một nghiệm thức tương ứng với một bẫy. Trong đó, có 7 nghiệm thức chứa ba hợp chất Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và Z11-16:OH riêng lẻ hoặc kết hợp. Nghiệm thức với mồi là 01 thành trùng cái chưa bắt cặp làm đối chứng dương và một nghiệm thức với mồi là tuýp cao su chỉ nhồi 5µl n- hexane làm đối chứng âm.
- Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận số lượng thành trùng sâu tơ đực vào bẫy 1 tuần/lần, chỉ tiêu theo dõi trong 4 tuần.
44
Bảng 3.1. Các nghiệm thức bố trí trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của thành phần pheromone giới tính đối với sâu tơ
Nghiệm thức
Thành phần mồi (mg/tuýp)
Z11-16:Ald Z11-16:OAc Z11-16:OH
A-1 0,5 0 0 A-2 0 0,5 0 A-3 0 0 0,5 A-4 0,25 0,25 0 A-5 0,5 0 0,05 A-6 0 0,5 0,05 A-7 0,25 0,25 0,05
A-8 01 TT cái chưa bắt cặp*
A-9 5 µl n-hexane
Ghi chú: *Thành trùng cái chưa bắt cặp được thay 3 - 4 ngày/lần
3.2.2.2. Ảnh hưởng của hàm lượng thành phần Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ
Kế thừa kết quả từ Mục 3.2.4.1 chọn mồi gồm hai thành phần Z11- 16:Ald và Z11-16:OAc (tỷ lệ 1:1) để tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thành phần Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính.
- Mục tiêu: xác định tỷ lệ phối trộn của hợp chất Z11-16:OH lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính đối với sâu tơ.
- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ ngày 30/02/2017 đến 27/03/2017.
- Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện trên ruộng cải bắp có diện tích 1.500 m2 tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng.
- Cách tiến hành: thí nghiệm bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 5 nghiệm thức và 3 lần lặp lại (Bảng 3.2). Mỗi lần lặp lại của một nghiệm thức tương ứng với một bẫy. Trong đó, 3 nghiệm thức được phối với nồng độ thay đổi của Z11-16:OH. Nghiệm thức với mồi là 01 thành trùng cái chưa bắt cặp làm đối chứng dương và một nghiệm thức với mồi là tuýp cao su chỉ nhồi 5 µl n-hexane làm đối chứng âm.
45
- Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận số lượng thành trùng sâu tơ đực vào bẫy 1 tuần/lần, chỉ tiêu theo dõi trong 4 tuần.
Bảng 3.2. Các nghiệm thức bố trí trong thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của Z11- 16:OH lên hiệu quả hấp dẫn mồi pheromone giới tính tổng hợp đối với sâu tơ
Nghiệm thức
Thành phần mồi (mg/tuýp)
Z11-16:Ald Z11-16:OAc Z11-16:OH
B-1 0,25 0,25 0,005
B-2 0,25 0,25 0,05
B-3 0,25 0,25 0,5
B-4 01 TT cái chưa bắt cặp*
B-5 5 µl n-hexane
Ghi chú: *Thành trùng cái chưa bắt cặp được thay 3 - 4 ngày/lần
3.2.2.3. Ảnh hưởng của hàm lượng mồi lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính tổng hợp Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và Z11-16:OH đối với sâu tơ
Kế thừa kết quả Mục 3.2.4.2 tiến hành tiếp thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng mồi lên hiệu quả hấp dẫn của mồi pheromone giới tính.
- Mục tiêu: xác định hàm lượng mồi pheromone giới tính cho hiệu quả hấp dẫn cao đối với thành trùng sâu tơ.
- Thời gian: thí nghiệm được tiến hành từ ngày 03/4/2017 đến 31/4/2017.
- Địa điểm: thí nghiệm được thực hiện trên ruộng cải bắp có diện tích 3.200 m2 tại xã Tham Đôn, huyện Mỹ Xuyên, tỉnh Sóc Trăng.
- Cách tiến hành: thí nghiệm bố trí theo thể thức khối hoàn toàn ngẫu nhiên một nhân tố với 9 nghiệm thức và 3 lần lặp lại (Bảng 3.3). Mỗi lần lặp lại tương ứng với một bẫy. Trong đó, 7 nghiệm thức là dãy hàm lượng từ 0,01 – 1,0 mg/tuýp cao su của hỗn hợp ba hợp chất Z11-16:Ald, Z11-16:OAc và
Z11-16:OH ở tỷ lệ phối trộn 5:5:1, tương ứng. Nghiệm thức với mồi là 01 thành trùng cái chưa bắt cặp làm đối chứng dương và một nghiệm thức với mồi là tuýp cao su chỉ nhồi 5µl n-hexane làm đối chứng âm.
- Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận số lượng thành trùng sâu tơ đực vào bẫy 1 tuần/lần, chỉ tiêu theo dõi trong 4 tuần.
46
Bảng 3.3. Các nghiệm thức bố trí trong thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hàm lượng của mồi pheromone lên hiệu quả hấp dẫn đối với sâu tơ
Nghiệm thức Thành phần mồi pheromone (tỷ lệ 5:5:1) Nồng độ (mg/tuýp) C-1 Z11-16:Ald, OAc, OH 0,01 C-2 Z11-16:Ald, OAc, OH 0,05 C-3 Z11-16:Ald, OAc, OH 0,1 C-4 Z11-16:Ald, OAc, OH 0,3 C-5 Z11-16:Ald, OAc, OH 0,5 C-6 Z11-16:Ald, OAc, OH 0,7 C-7 Z11-16:Ald, OAc, OH 1,0 C-8 01 TT cái chưa bắt cặp* -