Hợp chất 4 được thu nhận dưới dạng chất rắn màu trắng. Phổ khối va chạm electron ESI-MS cho thấy tín hiệu pic ion giả phân tử ở m/z 393 [M+NA]+. Kết hợp với các tín hiệu cộng hưởng trên phổ 13C-NMR cho phép xác định công thức phân tử của hợp chất 4 là C20H18O7.
Hình 3.15: Phổ ESI-MS của hợp chất 4
Trên phổ 1H-NMR của hợp chất 4 cho tín hiệu cộng hưởng của các proton vòng furo furan ở vùng trường cao δH 3.45-5.29 ppm, trong khi đó các proton của vòng 3',4'-methylenedioxyphenyl xuất hiện ở vùng trường thấp [OCH2O (δH 5.97, s), H-2' (δH 7.34, d, 1.5 Hz), H-5' (δH 6.91, d, 8.0 Hz),và H-6' (δH 7.42, dd, 1.5, 8.0 Hz)]. Ngoài ra, phổ 1H còn cho thấy tín hiệu của ba proton của vòng 1,3,4- trisubstitutedphenyl đặc trưng cho hệ ABX [H-2'' (δH 6.81, d, 2.0 Hz), H-6'' (δH
6.77, dd, 2.0, 7.5 Hz) và H-5'' (δH 6.98, d, 7.5 Hz) và proton của một nhóm methoxy 3''-OCH3 (δH 3.95, s).
Phổ13C-NMR của hợp chất 4 cho phép xác định sự có mặt của 20 nguyên tử cacbon trong phân tử bao gồm: sáu cacbon nhóm methine vòng thơm, bốn cacbon nhóm methine aliphatic, hai cacbon nhóm methylene liên kết với oxy, sáu cacbon bậc 4, một cacbon methoxy 3''-OCH3 (δC 56.0) và một cacbon cacbonyl C-8 (δC 176.8).
Hình 3.17. Phổ 13C của hợp chất 4
Hình 3.17: Phổ13C của hợp chất 4
Dựa vào cơ sở các dữ liệu phổ (1H và 13C-NMR) trên đây, gợi ý đến cấu trúc khung lignan furofuran cho hợp chất 4. Cấu trúc của 4 được khẳng định nhờ phân tích dữ liệu phổ HMBC.
Trên phổ HMBC, tương tác xa giữa proton của nhóm methine CH-1 [δH
3.45 (dd, 3.5, 9.5 Hz)] với C-2(δC 83.4) /C-4(δC 72.7) /C-8(δC 176.8), giữa proton của nhóm methine CH-5 (δH 3.20) với C-4 (δC 72.7) /C-6 (δC 84.5), giữa proton nhóm methine CH-2 [(δH 5.33, d, 4.0 Hz)] với C-5 (δC 56.0) và proton của nhóm methine CH-6 [5.29 (d, 4.0 Hz)] với C-1 (53.2)/C-8 (176.8) thiết lập nên vòng furofuran của phân tử. Tương tự, tương tác xa giữa proton của nhóm methylene OCH2O (δH 5.97, s) với C-3' (δC 148.0) /C-4' (δC 148.4), giữa proton H-2' (δH
6.90, d, 1.5 Hz) với C-3' (δC 148.0), giữa proton H-6' (δH 6.86, dd, 1.5, 8.0 Hz) với C-2' (δC 108.2)/C-4' (δC 148.4) thiết lập nên vòng 3',4'- methylenedioxyphenyl. Tương tác xa giữa proton của nhóm methine CH-2′′ (δH
6.81, d, 2.0 Hz) với C-3′′ (δC 146.8), giữa H-6′′ (δH 6.77, dd, 2.0, 7.5 Hz) với C- 2′′ (δC 108.5)/C-4′′ (δC 145.4) cho phép thiết lập nên vòng 1,3,4-trisubstitued
phenyl. Tại vòng đó, tương tác HMBC giữa proton của nhóm methoxy OCH3-3′′ (δH 3.95) với C-3′′(δC 56.0) cho phép xác định vị trí của nhóm methoxy OCH3 tại C-3′′. Vòng furofuran liên kết với vòng 3',4'-methylenedioxyphenyl tại vị trí cacbon C-2 được xác định bởi tương tác xa HMBC giữa H-2' (δH 6.90, d, 1.5 Hz) và H-6' (δH 6.86, dd, 1.5, 8.0 Hz) với C-2 (δC 83.4) cũng như sự liên kết giữa vòng furofuran và vòng 1,3,4-trisubstituted phenyl được xác định bởi tương tác xa giữa proton H-2′′ (δH 6.81, d, 2.0 Hz) và H-6′′ (δH 6.77, dd, 2.0, 7.5 Hz) với C-6 (δC
84.5).
Hình 3.18: Phổ HMBC của hợp chất 4
Từ những phân tích dữ liệu phổ trên và so sánh với tài liệu tham khảo [55] cho thấy hợp chất 4 là styraxin, được phân lập lần đầu tiên từ loài Styrax officinal [55].
3.1.5. Vladinol D (hợp chất 5)
Hợp chất 5 được phân lập từ cặn chiết EtOAc dưới dạng chất rắn màu trắng. Tín hiệu phổ khối phun mù điện tử ESI-MS được chỉ ra pic ion giả phân tửở m/z 397 [M+Na]+. Cùng với dữ liệu phổ13C cho phép xác định công thức phân tử của hợp chất 5 là C20H22O7.
Hình 3.20: Phổ ESI-MS của hợp chất 5
Phổ1H-NMR cho tín hiệu của proton thuộc ba nhóm methine aliphatic H- 8 (δH 4.28), H-7′ (δH 4.66, d, 9.0 Hz), H-8′ (δH 2.72); một nhóm methylene liên kết với oxy H-9 (4.19) và liên kết COSY giữa các proton H-9/H-8/H-8'/H-7' gợi ý đến cấu trúc của một vòng furan. Tương tác xa HMBC giữa proton của nhóm methylene liên kết với oxy H-9′ (δH 3.62, δH 3.67) với C-8′ (δC 54.6) cho phép xác định vị trí của nhóm này tại C-8′. Phổ 1H-NMR còn cho thấy tín hiệu cộng hưởng của các proton đặc trưng cho hệ ABX giữa H-2 (δH 7.61, d, 2.0 Hz), H-6 (δH 7.63, dd, 2.0, 9.0 Hz), and H-5 (δH 6.91, d, 9.0 Hz)] gợi ý đến sự có mặt của 1 vòng 1,3,4-trisubstituted benzoyl. Tương tự, tín hiệu của các proton hệ ABX giữa H-2' (δH 7.08, d, 2.0 Hz), H-6' (δH 6.87, dd, 2.0, 8.0 Hz), and H-5' (δH 6.78, d, 8.0 Hz)] gợi ý đến sự có mặt của 1 vòng 1,3,4-trisubstituted phenyl.
Hình 3.20. Phổ1H-NMR của hợp chất 5
Hình 3.21: Phổ 1H-NMR của hợp chất 5
Phổ 13C-NMR của hợp chất 5 cho thấy tín hiệu của 20 nguyên tử cacbon trong phân tử bao gồm: sáu cacbon methine vòng thơm, ba cacbon methine aliphatic, hai cacbon methylene liên kết với oxy (δC 56.47, C-7'; δC 61.3, C-9'), sáu cacbon bậc 4, hai cacbon methoxy [3-OCH3 (δC 56.47) và 3'-OCH3 (δC 56.41)] và một cacbon cacbonyl C-7 (δC 200,3).
Cấu trúc này của hợp chất 5 còn được khẳng định thông qua phổ HMBC. Trên phổ HMBC, tương tác giữa proton của nhóm methoxy -OCH3-3 (δH 3.93) với C-3 (δC 56.47) và nhóm methoxy -OCH3-3′ (δH 3.90) với C-3′ (δC 56.41) cho phép xác định vị trí của hai nhóm này lần lượt tại C-3 và C-3′. Vòng benzoyl gắn với vòng furan ở vị trí C-8 được xác định bởi tương tác xa giữa proton H-8 (δH
4.28) và H-9 (δH 4.19) với C-7 trong khi đó, tương tác xa giữa proton H-2′ và H- 6′ với C-7′ cho phép xác định vị trí của vòng phenyl được gắn tại C-7′. Từ việc phân tích chi tiết các dữ liệu phổ thu được và so sánh với tài liệu tham khảo [56,57] cho thấy hợp chất 5 có tên là Vladinol D. Chất này là một tetrahydrofuran lignan có mặt ở nhiều loài thực vật bậc cao như Vladimiria souliei or Forsythia suspensa, nhưng đây là lần đầu tiên được tìm thấy từ chi Styrax.
Hình 3.22: Phổ13C của hợp chất 5
Hình 3.23: Phổ HMBC của hợp chất 5
Hình 3.25: Phổ COSY của hợp chất 5
3.1.6. Ursolic acid (hợp chất 6)
Hợp chất 6 được phân lập dưới dạng chất rắn màu trắng, điểm nóng chảy 247-249oC. Phổ khối va chạm electron ESI-MS cho pic giả phân tử ở m/z 457 [M +H]+ cùng với các tín hiệu cộng hưởng trên phổ13C-NMR và DEPT cho phép xác định công thức phân tử của hợp chất 6 là C30H48O3.
Trên phổ1H-NMR của hợp chất 6 xuất hiện các tín hiệu của 5 nhóm methyl singlet ở δH 0.70 (3H, s); 0.74 (3H, s); 0.85 (3H, s); 0.91 (3H, s); 1.01 (3H, s) và 2 nhóm methyl doublet ở δH 0.78 (3H, d); 0.83 (3H, d). Sự có mặt của 1 proton thuộc nhóm olefinic methine cộng hưởng ởδH 5.20 (1H, t, J= 3.0 Hz) và 1 proton sp3 thuộc nhóm hydroxymethine cộng hưởng ở trường thấp δH 3,12 (dd, J = 1.5; 11.0 Hz) cũng được quan sát thấy trên phổproton tương ứng với H-12 và Hα-3.
Hình 3.27: Phổ1H của hợp chất 6
Phổ 13C-NMR và DEPT ghi nhận tín hiệu của 30 nguyên tử cacbon bao gồm: 7 nhóm methyl (CH3), 9 nhóm methylen (CH2), 6 nhóm methine (CH) sp3, trong đó có một nhóm hydroxymethine C-3 (δC 78.8), 1 nhóm methine(CH) sp2
C-12 (δC 125.4), 5 cacbon bậc 4 lai hóa sp3 (δC 39.4; 42.0; 36.8; 38.6; 47.8); 1 cacbon bậc 4 sp2 C-13 (δC 138.1), 1 nhóm cacboxylic -COOH (C-28, δC 180.5).
Hình 3.28: Phổ DEPT của hợp chất 6
Trên cơ sở phân tích các dữ kiện phổ MS, 1H, 13C, DEPT- NMR, cho phép gợi ý đến cấu trúc của hợp chất 6 là một pentacyclic triterpen khung ursan có một nhóm axit và 1 nhóm OH, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo [34] Bảng 3.1, có thể kết luận hợp chất 6 là axit ursolic (có cấu trúc như hình dưới đây).
Hình 3.29: Cấu trúc hóa học của hợp chất 6 Bảng 3.1: Dữ liệu phổ1H và 13C-NMR của hợp chất 6 TT #δC δCa,b δHa,c (độ bội, J =Hz) 1 38,6 38,7 2 27,4 26,8 3 78,5 78,8 3,12 (dd, J = 1,5; 11,0 Hz) 4 38,6 39,4
5 55,4 55,2 6 18,5 18,2 7 32,5 33,0 8 42,0 42,0 9 47,7 47,5 10 37,3 36,8 11 23,1 23,2 12 126,1 125,4 5,20 (1H, t, J= 3,0 Hz) 13 137,5 138,1 14 38,6 38,6 15 28,3 28,0 16 23,8 24,2 17 48,1 47,8 18 52,9 52,7 19 39 39,0 20 39 38,8 21 30,8 30,6 22 37,3 36,9 23 28,3 28,1 0,70 (3H, s) 24 15,8 15,5 0,74 (3H, s) 25 15,5 15,3 0,83 (3H, d, J= 6,5 Hz,) 26 17,3 16,9 0,91 (3H, s) 27 23,8 23,5 1,01 (3H, s) 28 181,7 180,5 29 17,3 16,9 0,78 (3H, d, J= 6,5 Hz) 30 21,4 21,0 0,85 (3H, s)
aĐo trong CDCl3& CD3OD, b125MHz, c500MHz, # δCđộ chuyển dịch hóa học của ursolic acid [34]
Như vậy, từ cặn chiết EtOAc lá cây Bồ đề lá bạc Styrax annanensis G., sử dụng các phương pháp sắc ký và các phương pháp phổ hiện đại đã phân lập và xác định cấu trúc hóa học của sáu hợp chất. Các hợp chất này thuộc lớp chất benzofuran, lignan furofuran, lignan tetrahydrofuran, pentacyclic triterpen. Đây là những lớp chất có mặt phổ biến ở các loài thực vật thuộc chi Bồđề Styrax.
Hình 3.30: Cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập từ cặn chiết EtOAc lá
cây BồĐề Trung Bộ
3.2. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH GÂY ĐỘC TẾ BÀO LÁ CÂY BỒ ĐỀ TRUNG BỘ
Các loài thực vật thuộc chi Bồđề Styrax được biết đến không chỉ có thành phần hóa học đa dạng, phong phú mà còn chứa đựng nhiều hoạt tính sinh học lý thú như: kháng ung thư, kháng viêm, chống virut, chống oxy hóa... Tuy nhiên, cho tới nay hầu như chưa có công trình nào công bố về hoạt tính sinh học của cây Bồ đề Trung Bộ Styrax annamensis G. Do đó, trong nghiên cứu này, ba cặn chiết và sáu hợp chất phân lập từ lá cây Bồ đề lá bạc được tiến hành thử nghiệm khả nănggây độc tế bào trên bốn dòng ung thư: biểu mô biểu bì miệng (KB), ung thư phổi (LU-1), ung thư gan (HepG2) và ung thư vú (MCF7) bằng phương pháp MTT đã được mô tả ở phần 2. Phương pháp. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.2.
Bảng 3.2: Hoạt tính gây độc tế bào của cặn chiết và chất sạch lá cây Bồđề Trung Bộ Styrax annamensis Guill.
Hợp chất
Tên chất Giá trị IC50 trên các dòng tế bào (µg/ml)
KB HepG2 Lu MCF7 Cặn n-hexan 95.4±1.56 92.3±1.69 92.7±1.54 >128 Cặn EtOAc 47.04±0.44 59.59±0.41 57.49±0.87 49.3±0.63 Cặn MeOH >128 >128 >128 >128 1 Eugonol (1) 22.87±0,65 17.24±0,53 24.93±0.35 34.81±1.08 2 Eugonoic acid (2) >128 >128 >128 >128 3 Machicendiol (3) 59.21±3.28 88.10±1.76 77.89±2.97 >128 4 Styraxin (4) >128 >128 >128 >128 5 Vladinol D (5) >128 >128 >128 >128 6 Ursolic acid (6) 57.88±1.57 76.42±2.27 76.31±1.73 66.35±1.77 Chất tham khảo Ellipticine 0.46 ± 0.03 0.43 ± 0.03 0.38 ± 0.02 0.36 ± 0.02
Kết quả ở Bảng 3.2 cho thấy, cặn chiết n-Hexan và EtOAc có hoạt tính trên cả 4 dòng tế bào ung thư thực nghiệm, trong đó cặn chiết EtOAc thể hiện hoạt tinh mạnh hơn với giá trị IC50 trong khoảng 47.04±0.44- 59.59±0.41µg/ml. Trong số sáu chất sạch được thử nghiệm thì có hai chất thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức trung bình khá trên cả 4 dòng tế bào ung thư , đó là Egonol (hợp chất 1) và Machicendiol (hợp chất 3), trong đó Egonol có hoạt tính ức chế bốn dòng ung thư HepG2, KB, Lu1 và MCF7 mạnh nhất với giá trị IC50 lần lượt là 17.24±0.53; 22.87±0.65; 24.93±0.35 và 34.81±1.08 µg/ml. Ursolic acid (hợp chất 6) thể hiện hoạt tính ở mức trung bình. Ba hợp chất còn lại là Egonoic acid, Styraxin và Vladinol D không thể hiện hoạt tính gây độc trên 4 dòng tế bào khi thử tới nồng độ 128µg/ml.
Liên hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học ta thấy, trong dãy hợp chất benzofuran, Egonol (1), egonoic acid (2) và machicendiol (3) có khả năng
ức chế tếbào ung thư khác nhau. Cả 3 chất này đều có cấu tạo khung benzofuran giống hệt nhau, chỉ khác nhau ở mạch nhánh hydroxypropyl. Eugonol có 1 nhóm – OH ở vị trí C-3′′ có hoạt tính gây độc tế bào mạnh nhất. Machicendiol có thêm 1 nhóm –OH ở vị trí C-1′′ làm giảm hoạt tính của phân tử còn Egonic acid nhóm –OH ở vị trí C-3′′ bị thay thế bằng nhóm cacbonyl –COOH làm phân tử mất hẳn hoạt tính. Như vậy, có thể thấy nhóm – OH ở vị trí C-3′′ của mạch nhánh hydroxypropyl là yếu tố quan trọng tạo nên hoạt tính ức chế tế bào ung thư của dãy chất benzofuran này.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN KẾT LUẬN
Sau một thời gian nghiên cứu thu thập tài liệu và tiến hành thực nghiệm, chúng em đã thu được một số kết quả chính như sau:
1. Đã nghiên cứu chiết tách và phân lập được sáu hợp chất từ cặn chiết EtOAc lá cây Bồ đề Trung Bộ (Styrax annamensis Guill.), bao gồm ba hợp chất khung benzofuran: Egonol, Egonoic acid, Machicendiol; Một hợp chất lignan furofuran: Styraxin, một hợp chất lignan tetrahydrofuran: Vladinol D và một hợp chất pentacyclic triterpene: Acid Ursolic. Machicendiol (3) và Vladinol D (5) lần đầu tiên được phân lập từ chi Bồđề Styrax.
2. Đã đánh giá hoạt tính gây độc tế bào của các cặn chiết và các chất sạch trên 4 dòng tế bào ung thư: biểu mô biểu bì miệng (KB), ung thư phổi (LU-1), ung thư gan (HepG2) và ung thư vú (MCF7). Hợp chất 1 (Egonol) có hoạt tính trung bình đến khá trên 4 dòng tế bào ung thư, với giá trị IC50 trong khoảng là 17.24±0.53- 34.81±1.08 µg/ml.
KIẾN NGHỊ
1. Cần tiếp tục nghiên cứu phân lập các chất ở các cặn chiết n-hexan, MeOH cũng như ởcác phân đoạn khác của cặn EtOAc để hoàn thiện nghiên cứu về thành phần hóa học lá cây Bồ đề Trung Bộ.
2. Cần tiếp tục mở rộng nghiên cứu thử nghiệm đánh giá các hoạt tính sinh học khác như chống oxy hóa, kháng viêm... để góp phần làm sáng tỏ tác dụng dược lý của loài thực vật này.
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢLIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Nguyen Thanh Tra, Tran Dang Anh, Pham Van Cuong, Nguyen Thị Thu Ha, Le Thi Tu Anh, Ba Thi Cham, Ninh The Son. Chemical constituents from the leaves of Styrax annamensis Guill. Tạp chí hóa học 2020.vol 58, issue 5: 630-
636.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Fatemeh Jamshidi-Kia, Zahra Lorigooini, Hossein Amini-Khoei. Medicinal plants: Past history and future perspective. J Herbmed Pharmacol. 2018. 7(1): 1-7.
2. Kruczynski A, Hill BT. Vinflunine, the latest Vinca alkaloid in clinical development. A review of its preclinical anticancer properties. Crit Rev Oncol Hematol. 2001. 40(2):159-73.
3. F K Engels, A Sparreboom, R A A Mathot and J Verweij. Br J Cancer. Potential for improvement of docetaxel-based chemotherapy: a pharmacological review. 2005. 93(2): 173–177.
4. Đặng Huy Huỳnh, Hồ Thanh Hải và cs, 2011, Báo cáo quốc gia về đa dạng sinh học, Bộtài nguyên và môi trường, chương 1, tr. 2-12.
5. Peter W. Fritsch (2001) Flora of North America. 8: 340
6. William E. Schadel and William C. Dickison (1979) Leaf anatomy and venation patterns of the Styracaceae. Journal of the Arnold Arboretum 60 (1): 8-37
7. Phạm Hoàng Hộ (2000) Cây cỏ Việt Nam NXB Trẻ quyển 1: 659-662
8. Patrícia M. Pauletti; Helder L. Teles; Dulce H.S. Silva; Ângela R. Araújo; Vanderlan S. Bolzani (2006) The Styracaceae. Brazilian Journal of Pharmacognosy 16 (4): 576-590
9. Watanabe, H., Abe, K.I., Kawai, K. & Siburian, P., (1996) Sustained use of highland forest stands for benzoin production from Styrax in north Sumatra, Indonesia. Wallaceana 78: 15-19
10.Masakazu Kashio, Dennis V. Johnson (2001) Monograph on benzoin Balsamic resin from Styrax. FAO of the United Nations Regional Office for Asia and the Pacific Bangkok, Thailan
11.Hüseyin Anil (1980) Four benzofuran glycosides from Styrax officinalis.
Phytochemistry. 19 (12): 2784-2786
12.Masahide Takanashi. Author links open the author workspace.Yasuomi Takizawa (1988) New benzofurans related to egonol from immature seeds of Styrax obassia. Phytochemistry 27 (4): 1224-1226
13.Yurdanur Yayla Akgul. Huseyin Anil (2003) Benzofurans and another constituent from seeds of Styrax officinalis. Phytochemistry 63 (8): 939-943 14.2-Aryl benzofurans and their derivatives from seeds of Styrax macranthus.
Yinggang Luo. Zhiheng He. Hongjuan Li. Fitoterapia. 78 (3) (2007): 211- 214.
15.Chen Q.F., Li G.Y., Zhang G.L (2012) Two new 2-phenylbenzofurans from the bark of Styrax perkinsia Chinese Journal of Natural Medicines. 10 (2): 92-97
16.Patricia Mendonça Pauletti. Angela Regina Araújo. Maria Claudia Marx Young. Astréa M Giesbrecht. Vanderlan da Silva Bolzani (2000) nor-Lignans
from the leaves of Styrax ferrugineus (Styracaceae) with antibacterial and antifungal activity. Phytochemistry 55 (6): 597-601
17. Zhang YM, Zhang PZ (2015) Lignans from Stem Bark of Styrax perkinsiae.
Zhong Yao Cai 38 (6):1202-5
18.Li QL, Li BG, Qi HY, Gao XP, Zhang GL 2005. Four new benzofurans from seeds of Styrax perkinsiae. Planta Med 71: 847-851
19.Teles HL, Hemerly JP, Paulettit PM, Pandolfi JR, Araujot AR, Valentini SR, Young MC, Bolzani VS, Silva DH (2005) Cytotoxic lignans from the stems of Styrax camporum (Styracaceae). Nat Prod Res 19 (4): 319-23 20.Oliveira PF , Damasceno JL, Bertanha CS, Araújo AR, Pauletti PM, Tavares
DC (2016) Study of the cytotoxic activity of Styrax camporum extract and its chemical markers, egonol and homoegonol. Cytotechnology. 68 (4):1597-
602.
21.Kim M-R, Lee H-H, Hahm K-S, Moon Y-H, Woo E-R 2004b. Pentacyclic triterpenoids and their cytotoxicity from the stem bark of Styrax japonica S. et Z. Arch Pharm Res 27: 283-286
22.Wang F, Hua HM, Bian X, Pei YH, Chen D, Jing YK (2006a) Triterpenoids from the resin of Styrax tonkinensis and their antiproliferative and differentiation effects in human leukemia HL-60 cells. J Nat Prod 69: 807-