4. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI
3.4.1. Tinh trùng heo rừng
3.4.1.1. Đánh giá một số đặc điểm tinh heo rừng
Giá trị pH: Giá trị pH được thể hiện trong bảng 3.10 dưới đây, chúng tôi so sánh giá trị pH giữa các nhóm heo rừng Tây Nguyên và nhóm heo khác. Giá trị pH của tinh heo từ các giống Landrace khoảng bằng 7, trong khi đó tinh heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên có giá trị pH bằng 6 (Bảng 3.10). Giá trị pH đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá chất lượng tinh trùng. Giá trị pH của tinh heo nói
xuống còn khoảng 6,69 cho đến 7,06 khi tinh dịch được bảo quản ở nhiệt độ mát trong khoảng 96 giờ [82]. Trong nghiên cứu này, chúng tôi thấy rằng nhóm tinh dịch giống Landarace đều có giá trị pH bằng 7, đây đều là nhóm tinh dịch được thu nhận và bảo quản lạnh. Trong khi đó giá trị pH của tinh dịch heo rừng thu từ mào tinh bằng 6. Giá trị này phù hợp với các nghiên cứu trước đây, vì giá trị pH của tinh dịch thu từ mào tinh dao động từ 5.57 cho đến 6.9 [48]. Kết quả này cho thấy, giá trị pH của tinh dịch thu từ mào tinh nhỏ hơn so với giá trị pH của tinh dịch khi xuất ra
bên ngoài.
Bảng 3.10.Các thông số của tinh dịch
Thông số Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên Giống Landrace ST: 3350 Giống Landrace Đại học Nông Lâm
pH 6 7 7 Mật độ tinh trùng 498,67 ± 9,30 x 106 (c) 191,44 ± 3.18 x 106 (a) 291,20 ± 7.77 x 106 (b) Tỉ lệ sống chết 91,20 ± 1,17 % (c) 68,46 ± 2,49 % (a) 68,99 ± 1,29 % (b) Dạng kết dính A,B,C,D C,D C,D
a, b, c: khác biệt có ý nghĩa thống kê (P≤ 0,05)
Mật độ tinh trùng: Kết quả đánh giá mật độ tinh trùng cho thấy, heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên có mật độ tinh trùng cao hơn so với các giống heo khác (Bảng 3.10). Mật độ tinh trùng của các giống heo khác nhau rất khác nhau, chúng có thể dao động từ 10 triệu cho đến 1 tỉ trinh trùng/ml [15]. Trong nghiên cứu Hafez và cộng sự, mật độ tinh trùng trung bình là 10-20 x 106 tinh trùng/ml [43].
Trong nghiên cứu của Kommisrud và cộng sự, mật độ tinh trùng của giống Duroc là
133x106 tinh trùng/ml; giống Landrace là 86 x 106 tinh trùng/ml; giống Yorkshire là
117 x 106 tinh trùng/ml [59]. Trong một nghiên cứu khác của Strzezek và cộng sự, mật độ tinh trùng của giống Chester có thể lên đến 363 x 106 tinh trùng/ml [112].
Trong nghiên cứu này, mật độ tinh trùng chúng tôi thu được từ mào tinh heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên là 498,67 ± 9,30 x 106. Mật độ này lớn hơn rất nhiều so với mật độ tinh trùng thu từ nhóm heo Landrace của công ty Greenfeed và Đại học Nông Lâm, cũng như các nhóm heo khác đã được nghiên cứu trên thế giới ở trên. Với lượng mật độ lớn như vậy, nguồn tinh trùng thu từ mào tinh của heo
rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên này có thể được lưu trữ cho các mục đích bảo tồn, chúng có thể được sử dụng cho tạo phôi bằng phương pháp vi tiêm tinh trùng vào trứng.
Tỉ lệ sống của tinh trùng: Phương pháp nhuộm eosin-nigrosin được áp dụng để xác định sự sống/chết của tinh trùng heo. Tinh trùng có đầu sáng trắng không vẩn đục, không bắt màu thuốc nhuộm là tinh trùng sống, còn tinh trùng chết là tinh trùng bắt màu thuốc nhuộm và có màu hồng (Hình 3.9). Kết quả tỉ lệ sống chết được mô tả trong bảng 3.10. Tinh trùng thu từ mào tinh của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên có tỉ lệ sống cao hơn nhiều so với tinh trùng của công ty Greenfeed và Đại học Nông Lâm.
Hình 3.9.Tinh trùng nhuộm Eosin-Nigrosin. A: Tinh trùng Giống Landrace ST: 3350, B: Tinh trùng Giống Landrace Đại học Nông Lâm, C: Tinh trùng heo rừng
thuần có nguồn gốcTây Nguyên
Trong quá trình sinh sản tinh trùng, tinh trùng hình thành từ ống sinh tinh, sau đó đi vào mào tinh rồi theo ống dẫn tinh đi đến một số cơ quan khác trước khi đi ra ngoài bởi quá trình xuất tinh. Trong quá trình trưởng thành này, tinh trùng
trong mào tinh thường có tỉ lệ sống cao hơn so với tinh trùng ở các cơ quan tiếp sau đó. Do đó, tỉ lệ tinh trùng sống cao của heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên là
điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu đông lạnh để bảo quản nguồn tinh trùng.
Đánh giá sự kết dính tinh trùng (Aggregation): Các tinh trùng bất động có thể bám dính vào các tinh trùng di động tạo thành cụm, ngoài ra các mảnh mô hay tế bào cũng có thể bám vào tinh trùng di động. Các dạng tinh trùng được mô tả
trong các hình 3.10 và bảng 3.10. Tinh trùng heo Giống Landrace ST: 3350 Công ty Greenfeed và Giống Landrace Đại học Nông Lâm có dạng 3 là chủ yếu, tức là tinh trùng có bám dính vào các tế bào biểu mô hay mảnh mô, trong khi đó tinh trùng heo
A B
rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên có cả3 dạng bao gồm các dạng trên và dạng tinh trùng tự do.
Hình 3.10.Sự kết dính tinh trùng. A: Tinh trùng Giống Landrace ST: 3350, B: Tinh trùng Giống Landrace Đại học Nông Lâm, C: Tinh trùng heo rừng thuần Tây Nguyên
Kỳ hình tinh trùng heo rừng: Các dạng kỳ hình của tinh trùng được mô tả
trong hình 3.11. Hình 3.11A cho thấy tinh trùng giống heo rừng thuần có nguồn gốc Tây nguyên bình thường có đuôi thẳng và đầu tinh trùng nguyên vẹn, tinh trùng sáng đều, không phân mảnh. Trong quá trình quan sát, chúng tôi nhận thấy tinh trùng heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên chủ yếu có những dạng kì hình xảy ra ở vùng đuôi tinh trùng, chúng tôi không nhận thấy những bất thường xảy ra ở vùng đầu tinh trùng. Hình 3.11B cho thấy đuôi tinh trùng heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên cuộn tròn tạo thành vòng ở vùng đuôi bên dưới. Hình 3.11C cho
thấy đuôi tinh trùng heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên uốn cong lên phía
trên đầu tinh trùng. Hình 3.11D mô tả tinh trùng heo rừng thuần Tây Nguyên bị dị dạng ở phần thân và đuôi, phần thân tinh trùng bị teo nhỏ lại còn phân đuôi ngắn uốn cong lên phần đầu của tinh trùng. Hình 3.11E mô tả tinh trùng có phần đuôi bị gập lại. Hình 3.11F mô tả tinh trùng có đuôi bị xoắn phần cuối đuôi. Hình 3.11G
mô tả tinh trùng có phần đuôi bị xoắn ngay vị trí giữa đuôi. Hình 3.11H mô tả tinh trùng có phần đuôi bị xoắn ngay vị trí tiếp xúc với phần thân tinh trùng.
A B
Hình 3.11. Kỳ hình tinh trùng heo rừng thuần Tây Nguyên
3.4.1.2. Đông lạnh tinh trùng
Ảnh hưởng của tiến trình hạ nhiệt
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát thời gian hạ nhiệt độ trong quá trình đông lạnh tinh trùng heo rừng theo các nghiệm thức sau:
Nghiệm thức 1: 20cm (5 phút) + 15cm (5 phút) + Nitơ lỏng Nghiệm thức 2: 20cm(5 phút) + 15cm (15 phút) + Nitơ lỏng Nghiệm thức 3: 20cm (5 phút) + 10cm (5 phút) + Nitơ lỏng Nghiệm thức 4: 20cm (5 phút) + 10cm (15 phút) + Nitơ lỏng Nghiệm thức 5: 20cm (5 phút) + 5cm (5 phút) + Nitơ lỏng Nghiệm thức 6: 20cm (5 phút) + 5cm (15 phút) + Nitơ lỏng
Trong nghiên cứu đông lạnh tinh trùng, tinh trùng heo rất nhạy cảm với nhiệt độ thấp hơn 15oC. Khả năng sống của tinh trùng sẽ giảm rõ rệt nếu nhiệt độ thấp hơn 15oC trong vòng vài giờ, được gọi là shock lạnh. Quá trình shock lạnh này gây
ra những sai hỏng trong màng tế bào tinh trùng, do đó nó ảnh hưởng tới quá trình biến dưỡng của tinh trùng. Tinh trùng bị shock lạnh có thể giảm tỉ lệ sống và mất khả năng thụ tinh.
Sau khi đông lạnh, tinh trùng đông lạnh sẽ được giải đông và đánh giá tỉ lệ sống chết dựa trên phương pháp nhuộm eosin-nigrosin. Số tinh trùng sống chết sẽ được đếm trong 200 tinh trùng.
A B C D
Bảng 3.11. Tỉ lệ tinh trùng sống sau giải đông ở các nghiệm thức khác nhau. Nghiệm thức
1 2 3 4 5 6
Tỉ lệ tinh
trùng sống 23,67%a 30,67%b 24,67%a 37,83%c 35,33%d 40,67%e Trong quá trình đông lạnh tinh trùng, bước đầu tiên hạ nhiệt từ 25oC xuống - 5oC phải đạt tốc độ 6oC/phút. Do đó, trong quá trình đông lạnh, chúng tôi chọn khoảng cách làm lạnh so với mực nitơ lỏng ở khoảng cách 20cm trong vòng 5 phút
là phù hợp nhất.
Trong quá trình đông lạnh, việc giảm nhiệt độ từ -15oC xuống -60oC có vai
trò rất quan trọng, chúng ảnh hưởng trực tiếp tới tinh trùng [73]. Nó ảnh hưởng trực tiếp tới sự hình thành tinh thể đá và quá trình khử nước trong tế bào. Ngoài ra, nếu quá trình đông lạnh diễn ra chậm, tinh trùng sẽ phải tiếp xúc với môi trường có nồng độ muối cao, làm tế bào mất nước, không những thế quá trình khử nước cũng diễn ra ở cả màng tế bào. Tế bào tinh trùng rất nhạy với áp suất thẩm thấu [38]. Do đó, trong nghiên cứu này chúng tôi khảo sát các khoảng cách và thời gian chủ yếu nằm trong khoảng từ -15oC xuống -60oC. Kết quả cho thấy nghiệm thức 1, nghiệm thức 3 có tỉ lệ tinh trùng sống thấp nhất. Nghiệm thức 6 có tỉ lệ tinh trùng sống cao nhất là 40,67%, trong khi đó nghiệm thức 4 có tỉ lệ tinh trùng sống là 37,83% và nghiệm thức 5 có tỉ lệ tinh trùng sống là 35,33% và nghiệm thức 2 có tỉ lệ tinh trùng sống là 30,67% (Bảng 3.14) . So với nghiên cứu khác, kết quả của chúng tôi có tỉ lệ tinh trùng sốngcao hơn sau khi giải đông. Trong nghiên cứu của Panida và cộng sự năm 2011, tỉ lệ tinh trùng sống là 38,10% [80]. Tỉ lệ sống của tinh trùng sau giải đông trong nghiên cứu này có tỉ lệ cao nhất là 40,67%. Như vậy, nghiệm thức 4, nghiệm thức 5 và nghiệm thức 6 có tốc độ làm lạnh phù hợp cho quá trình đông lạnh tinh trùng heo rừng, trong đó quá trình đông lạnh theo nghiệm thức 6 (20cm (5
phút) + 5cm (15 phút) + Nitơ lỏng) là phù hợp nhất cho đông lạnh tinh heo rừng thuần Tây Nguyên.
Ảnh hưởng của nồng độ glycerol
Tỷ lê ̣ sống của tinh trùng đông la ̣nh được đánh giá sau thời gian đông la ̣nh 1 tháng. Trong quá trình đông lạnh tinh trùng, chúng tôi sử dụng môi trường đông lạnh bổ sung glycerol ở các nồng độ khác nhau là 5%, 10%, 15% và 20%.
Kết quả tỉ lệ sống chết của tinh trùng heo rừng khi bảo quản trong môi trường bổ sung glycerol ở các nồng độ khác nhau được mô tả trong bảng dưới đây. Tỉ lệ sống chết trong môi trường đông lạnh có nồng độ glycerol 15% là cao nhất trong khi đó, các môi trường đông lạnh có nồng độ glycerol khác có tỉ lệ sống/chết thấp hơn như nồng độ 5%, 10% và nồng độ 20% (Bảng 3.15). Kết quả trên cho thấy nồng độ glycerol 15% bổ sung vào môi trường đông lạnh là thích hợp nhất cho quá trình đông lạnh tinh heo rừng thuần Tây Nguyên thu từ mào tinh.
Bảng 3.12. Tỷ lê ̣ sống của tinh trùng thu từ mào tinh đông la ̣nh Nồng độ glycerol (%)
5 10 15 20
Tỉ lệ tinh trùng sống
13,66%a 12,94%a 25,59%b 19,71%c So sánh với một số nghiên cứu khác trên thế giới, kết quả tỉ lệ sống của tinh
trùng sau giải đông của chúng tôi thu được cao hơn. Tỉ lệ tinh trùng sống sau giải đông trong nghiên cứu của William và cộng sự năm 2005 là 22,7%. Kết quả của chúng tôi cũng cao hơn so với kết quả đông lạnh và giải đông tinh trùng trong nghiên cứu của Roca và cộng sự 2006 là 25,02%. Trong nghiên cứu của Roca và cộng sự năm 2006, thành phần môi trường đông lạnh chứa các muối bình thường như NaCl 20,39 mM, KCl 5.4 mM, NaHCO3 15.01 mM và EDTA 3.35 mM bổ
sung beta-lactose 310 mM và lòng đỏ trứng gà 20% [95]. Trong nghiên cứu của chúng tôi, chúng tôi bổ sung glycerol như là chất bảo quản đông lạnh, việc bổ sung này giúp nâng cao hiệu quả đông lạnh trong môi trường do chúng tôi pha chế so với môi trường của Roca và cộng sự.
Kết quả trên cho thấy môi trường đông lạnh chúng tôi sử dụng thích hợp cho việc đông lạnh tinh heo từ mào tinh. Đây là lần đầu tiên, quy trình đông lạnh tinh heo từ mào tinh được nghiên cứu. Kết quả thu được là rất khả quan.