4. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI
3.4.2. Đông lạnh tế bào
Trong nghiên cứu này, tế bào từ mô tai heo rừng thuần có nguồn gốc Tây
Nguyên được phân lập và nuôi cấy sau đó tế bào được bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng. Trong quá trình nuôi cấy, mảnh mô bắt đầu dính vào đĩa nuôi cấy ở ngày thứ 3. Ngày thứ 5 – 6, các tế bào nuôi cấy bắt đầu phát triển và mọc xung quanh
miếng mô tai heo. Sau 10 ngày nuôi cấy, tế bào mọc kín khoảng 90-95% bề mặt đĩa
nuôi (Hình 3.12). Tế bào phát triển từ mô da tai heo có hình dạng thon dài, phẳng, nhân kéo dài và có nhiều nhánh, đây là đặc điểm đặc trưng của nguyên bào sợi. Sau
10 ngày nuôi cấy, khi tế bào phát triển nhiều, tế bào sẽ được cấy chuyền qua đĩa nuôi cấy mới. Trong quá trình cấy chuyền, tế bào biểu bì giảm dần và thường từ lần cấy chuyền thứ 4 trở đi tế bào biểu bì, tế bào sừng không còn hiê ̣n diê ̣n, chỉ còn lại
nguyên bào sợi trong môi trường nuôi cấy (Hình 3.13).
Hình 3.12. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên nuôi cấy sơ cấp. A: Tế bào sau 4 ngày nuôi(x 20). B: Tế bào sau 10 ngày nuôi (x 10). C: Tế bào sau 10 ngày nuôi (x
20). D: Tế bào lan tỏa đa ̣t cấy chuyền (x 10).
Hình 3.13. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên nuôi cấy chuyền. A: Tế bào sau khi tách bằng trypsin/edta 0,25% (X20). B: Tế bào sau 24h cấy chuyền lần 1 (X10). C: Tế bào sau 48h cấy chuyền lần 1 (X10). D: Tế bào sau 48h cấy chuyền lần 2 (X20). E: Tế
bào sau 48h cấy chuyền lần 2 (X20). F: Tế bào sau 72h cấy chuyền (X10). Sau khi cấy chuyền, tế bào sẽ được tách bằng trypsin và được bảo quản đông lạnh trong nitơ lỏng. Sau khi đông lạnh một tháng, tế bào được giải đông và nuôi
cấy để kiểm tra sức sống và khả năng tăng sinh của tế bào. Kết quả cho thấy, sau khi giải đông tỉ tệ sống của tế bào là 60%. Tế bào tăng sinh và phát triển mạnh sau
3-4 ngày sau giải đông và đạt mật độ nuôi cấy 90-95% sau 5-6 ngày (Hình 3.14). Tế bào nuôi cấy sau giải đông vẫn giữ được hình dạng thon dài, phẳng, nhân kéo dài và có nhiều nhánh. Điều đó chứng tỏ nguyên bào sợi vẫn giữ nguyên đặc điểm hình thái trong quá trình đông lạnh.
Hình 3.14. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên sau giải đông. A, B, C: tế bào nuôi cấy sau khi giải đông 1 ngày. A1, B1, C1: tế bào nuôi cấy sau khi giải đông 3 ngày.
KẾT LUẬN
- Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên thu nhận được là loài heo Sus scrofa Linnaeus, 1758.
- Quá trình thu thập, nuôi thuần dưỡng heo rừng Tây Nguyên đạt tỉ lệ thuần hóa thành công sau 6 tháng cao nhất 81,82% ở những cá thể có trọng lượng nhỏ (dưới 10 kg).
- Đã xác định được các đặc điểm sinh học và các thông số cơ thể của heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên.
- Đánh giá được vị trí của heo rừng có nguồn gốc khu vực Tây Nguyên trong mối quan hệ phát sinh loài của heo rừng trên thế giới. Xác định được 3 vị trí SNP mới của vùng D-loop và 3 vị trí SNP mới của gene cytochrome b của heo rừng có
nguồn gốc Tây Nguyên, giúp phân biệt giữa heo rừngcó nguồn gốc Tây Nguyên và
các nhóm heo rừng khác.
- Đã xác định được các đặc điểm sinh học của tinh trùng heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên thu từ mào tinh: pH = 6, mật độ là 498,67 ± 9,3 x 106, tỉ lệ sống 91,20% ± 1,17; có 4 dạng kết dính…
- Tỉ lệ sống của tinh trùng heo rừng thuần Tây Nguyên sau giải đông là
40,67%. Tỉ lệ sống của tế bào sau giải đông là 60%, tế bào tăng sinh và phát triển mạnh đạt mật độ nuôi cấy 90-95% sau 5-6 ngày.
ĐỀ NGHỊ
- Tiếp tục có các nghiên cứu sâu hơn vềđặc điểm sinh học của heo rừng thuần
Tây Nguyên trong điều kiện tự nhiên và thuần hóa.
- Phân tích các trình tự còn lại của ADN ty thể để có thể xây dựng được bộ
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ
1. Nguyễn Thị Phương Mai, Lê Ngọc Châu, Nguyễn Khắc Duy, Lê Thành
Long, Hoàng Nghĩa Sơn, 2012. Phân tích một số đặc điểm đa hình và mối quan hệ phát sinh loài của lợn rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên dựa trên trình tự gen
cytochrome bty thể. Tạp chí Sinh học, 34(3SE): 285-291.
2. Nguyễn Thị Phương Mai, Lê Thành Long, Diệp trung Cang, Võ Thành Trung, Nguyễn Thị Phương Thảo, Hoàng Nghĩa Sơn, 2015. Đánh giá một số đặc
điểm tinh trùng thu từ mào tinh lợn rừng bản địa Tây Nguyên (Sus scrofa). Tạp chí Công nghệ Sinh học, 13(4A): 1195-1201.
3. Hoàng Nghĩa Sơn, Nguyễn Thị Phương Mai, Hà Thanh Tùng, Lê Thị Châu, Nguyễn Hữu Duân, Nguyễn Khắc Duy, Đoàn Chính Chung, Đỗ Minh Sĩ, Lê Thành Long, 2013. Đánh giá mối quan hệ di truyền của heo rừng Việt Nam dựa trên vùng D-loop ty thể. Tạp chí Sinh học, 35(3SE): 200-206
4. Le Thanh Long, Nguyen Thi Phuong Mai, Doan Chinh Chung, Do Minh Si, Ho Nguyen Quynh Chi, Hoang Nghia Son, 2014. The gentic relationship of Vietnamese pigs in Central highlands assessed by cytochrome b. Open Journal of Gentics., 4 (5): 362-369.
5. Hoàng Nghĩa Sơn, Lê Thành Long, Nguyễn Thị Phương Mai, 2014. Nghiên cứu một sốđặc điểm sinh học của lợn rừng (Sus scrofa) Tây Nguyên. Tạp chí Sinh học, 36(2): 253-258.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Nguyễn Chung (2012), Kỹ thuật nuôi và nhân giống heo rừng – nhím bờm, NXB Nông nghiêp TP. Hồ Chí Minh.
2. Nguyễn Quang Mai, Cù Xuân Dần (2004), Sinh lý học vật nuôi, Nhà xuất bản Đại học Sư phạm
3. Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc, Trương Định, (2008), Công nghệ tế bào gốc, NXB Giáo dục.
4. Việt Chương, Nguyễn Việt Thi, (2007) Kỹ thuật nuôi heo rừng lai, NXB Mỹ thuật. 5. Việt Chương, Nguyễn Việt Thái (2010), Kỹ thuật chăn nuôi gia súc, nuôi heo
hướng nạc, NXB Tổng hợp TP. Hồ Chí Minh.
Tài liệu tiếng nước ngoài
6. Andrzejewski, R. & Jezierski, W. (1978). Management of a Wild Boar Population and its Effects on Commercial Land, Acta Theriologica, 23 (19), 309–339.
7. Aumaitre, A., Quere P. and Pieniau J. (1984). Influence du milieu sur la reproduction hivernale et la prolificité chez la laie. Symp. Internac. sur le Sanglier.
Les Colloques de l’INRA , 22: 69-78.
8. Bjorndahl L., (2003). Sequence of ejaculation affects the spermatozoon as a carrier and its message. Reproductive biomedicine online, 7, pp: 440-448.
9. Boitani, L., Mattei, L., Nonis, D. & Corsi, F. (1994). Spatial and activity patterns of wild boars in Tuscany, Italy. Journal of Mammalogy, 75, 600-612.
10. Bokonyi S. (1977). Animal Remains from the Kermanshah Valley, Iran. British Archaeological Reports Supplementary Series, No. 34. Oxford: Archaeopress. 11. Booth, W. D., Hughes-Parry, R. & Jackson, S. R. K. (1988). Wild boar farming.
12. Breininger, E., Beorlegui, N.B., O'Flaherty, C.M. and Beconi, M.T. 2005, Alpha- tocopherol improves biochemical and dynamic parameters in cryopreserved boar semen, Theriogenology. 63:2126-2135.
13. Brown, W.M., George, M. and Wilson, A.C. (1979) Rapid Evolution of Animal Mitochondrial DNA. Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA,
14. Budiansky S. (1992). The Covenant of the Wild: Why Animals Chose Domestication. New York, NY: William Marrow.
15. Cerolini, S., Maldjian, A., Pizzi, F., Gliozzi, T.M. (2001). Changes in sperm quality and lipid composition during cryopreservation of boar semen. Reproduction, 121: 395–401.
16. Chen C. H., Huang H. L., Yang H. Y., Lai S. H., Yen N. T., Wu M. C. and Huang M. C. (2011). Mitochondrial genome of Taiwan pig(Sus Scrofa). African Journal of Biotechnology, Vol. 10(13), pp. 2556-2561, 28 March, 2011.
17. Choquenot, D., McIlroy, J. and Korn, T. (1996).Managing Vertebrate Pests: Feral Pigs. Bureau of Resource Sciences, Australian Government Publishing Service, Canberra.
18. Coenye T., Vandamme P. (2003). “Intragenomic heterogenity between multiple 16S ribosomal RNA operons in sequenced bacterial genomes”, FEMS Microbiology
Letters, 228, pp. 45-49.
19. Anchamparuthy, V. (2007), Vitrification of Bovine oocytes: Doctor of Philosophy in Animal Science, Blacksburg, Virginia.
20. Dardaillon, M. & Beugnon, G. (1987). The influence of some environmental characteristics on the movements of wild boar. Biology of Behaviour, 12, 82-92. 21. Ebinger P. (1995). Domestication and plasticity in brain organization in mallards
(Anas platyrhynchos). Brain, Behavior, and Evolution 45: 286–300.
22. Eriksson, B.M., Petersson, H. and Rodriguez-Martinez, H. (2002). Field fertility with exported boar semen frozen in the new flatpack container. Theriogenology. 58: 1065-1079.
23. Erkinaro, E., Heikura, K., Lindgren, E., Pullianen, E. & Sulkava, S. (1982).
Occurrence and spread of the wild boar (Sus scrofa) in eastern Fennoscandia.
Memoranda Flora and Fauna Fennoscandia, 58 (2), 39–47.
24. Ervynck A, K Dobney, H Hongo, and RH Meadow. (2001). Born free? New evidence for the status of Sus scrofa at Neolithic ayo¨nu¨ Tepesi (SouthEastern Anatolia, Turkey). Pale´orient 27(2): 47–73.
25. Phan Kim Ngọc, Hồ Huỳnh Thùy Dương (2001). Sinh học của sự sinh sản. NXB
26. Fernández, A.I., Alves, E., Óvilo, C., Rodríguez, M.C. and Silió, L. (2010) Divergence Time Estimates of East Asianand European Pigs Based on Multiple near Complete Mitochondrial DNA Sequences. Animal Gentics, 42, 86-88.
27. Flannery KV. (1983). Early pig domestication in the Fertile Crescent: A retrospective look. Pp. 163–88 in TC Young, PEL Smith, and P Mortensen (eds.) The Hilly Flanks. Essays on the Prehistory of Southwest Asia, Studies in Ancient Oriental Civilization, No. 36. Chicago, IL: Oriental Institute, University of Chicago. 28. Florencio M., Carlos S., Rafael D.G. (2004). Physical development of wild boar in
the cantabric mountains, álava, northern spain, Galemys 16 (nº especial) , 25-34. 29. Fournier-Chambrillon, C., Maillard, D. & Fournier, P. (1996) Variability of the diet
of wild boars in the Montpellier garrigue. Gibier Faune Sauvage, 13, 1457-1476. 30. Funahashi, H. and Sano, T. (2005). Select antioxidants improve the function of
extended boar semen stored at 10 degrees C. Theriogenology. 63:1605-1616.
31. Gabor, T. M., Hellgren, E. C., Van Den Bussche, R. A. & Silvy, N. J. (1999).
Demography, sociospatial behaviour and gentics of feral pigs in a semi-arid environment. Journal of Zoology London, 247, 311-322.
32. Gadea, J., Selles, E., Marco, M.A., Coy, P., Matas, C., Romar, R. and Ruiz, S. (2004). Decrease in gluthathione content in boar sperm after cryopreservation, effect of the addition of reduced glutathione to the freezing and thawing extender.
Theriogenology. 62:690-701.
33. Genov, P. (1981a). Food Composition of Wild Boar in North-eastern and Western Poland. Acta Theriologica, 26 (10), 185–205.
34. Genov, P. (1981b). The significance of natural biocenoses and agrocenoses as the source of food for wild boar (Sus scrofa L.). Ekologia Polska, 29, 117–136.
35. Genov, P. V. (1999). A review of the cranial characteristics of the Wild Boar with systematic conclusions. Mammal Review, 29, 205-238.
36. Gerard, J.F. & Campan, R. (1988). Variabilité éco-ethologique chez le sanglier europeén: comparasion des travaux francais. Cahiers D’ethologie Appliquee, 8
(1), 63–130.
37. Gerrits, R.J., Lunney, J.K., Johnson, L.A., Pursel, V.G., Kraeling, R.R., Rohrer, G.A. and Dobrinsky, J.R. (2005). Perspectives for artificial insemination and genomics to improve global swine populations. Theriogenology. 63:283-299.
38. Gilmore, J.A., Junying, D., Jun, T., Peter, A.T. and Crister, J.K. (1996). Osmotic properties of boar spermatozoa and their relevance to cryopreservation. J. Reprod. Fertil. 107:87-95.
39. Giuffra E., Kijas J. M. H., Amarger V., Carlborg Ö., Jeon J.-T. and Andersson L. (2000). The origin of the domestic pig: Independent domestication and subsequent introgression. Gentics, 154, pp. 1785–1791.
40. Groves CPP and Oliver W (2008). Sus bucculentus. In: IUCN 2008. IUCN Red List of Threatened Species.
41. Groves, C. P., Schaller, G. B., Amato, G. and Khounboline, K. (1997). Rediscovery of the wild pig Sus bucculentus. Nature 386: 335.
42. Gordon, I.R. (2003), Laboratory Production of Cattle Embryos, 2nd ed: Cambridge MA, CABI Publishing, US.
43. Hale EB. (1969). Domestication and the evolution of behavior. Pp. 22–42 in ESE Hafez (ed.) The Behaviour of Domestic Animals, 2nd edition. London: Bailliere, Tindall, and Cassell.
44. Harris D. (1996). Introduction: Themes and concepts in the study of early agriculture. Pp. 1–9 in D Harris (ed.) The Origins and Spread of Agriculture and Pastoralism in Eurasia. London: University College Press.
45. Haugen TB, Grotmol T (1998). pH of human semen. International Journal of Andrology, 21:105-108.
46. Heude P.M. (1892). Etude sur les Suilliens, Chapitre II. Mémoires d’Histroire
naturelle de l’Empire Chinois, 2: 85-115; Chapitre III, loc.cit, 2: 212-222; Chapitre
V, Loc.cit, 4: 113-133.
47. Hongo, H., Ishiguro, N., Watanobe, T., Shigehara, N., Anezaki, T., Long, V.T., Binh, D.V., Tien, N.T. and Nam, N.H. (2002). Variation in Mitochondrial DNA of Vietnamese Pigs: Relationships with Asian Domestic Pigs and Ryukyu WildBoars. Zoological Science, 19, 1329-1335.
48. Ilinca frunză, h. Cernescu, gabriela korodi, (2008). Physical and chemical parameters of boar sperm. Lucrări Ştiinłifice Medicină Veterinară VOL. XLI, TIMIŞOARA, 634-640.
49. Ishiguro, N., Sasaki, M., Iwasa, M., Shigehara, N., Hongo, H., Anezaki, T., Long, V.T., Lan, D.T.B. and Long, P.T. (2008). mtDNA Variation in Vietnamese pigs,
with Particular Emphasis on the Gentic Relationship between WildBoars from Vietnam and the Ryukyu Islands. Mammal Study, 33, 51 -68.
50. Jezek M., Stipek K., Kust T. a, Cerveny J., Vicha J., (2011).Reproductive and morphometric characteristics of wild boar (Sus scrofa) in the Czech republic.
JOURNAL OF FOREST SCIENCE, 57 (7): 285–292.
51. Jiang Y. N., Wu C. Y., Huang C. Y., Chu H. P., Ke M. W., Kung M. S., Li K. Y., Wang C. H., Li S. H., Wang Y. and Ju Y. T. (2008). Interpopulation and intrapopulation maternal lineage gentics of the Lanyu pig (Sus scrofa ) by analysis of mitochondrial cytochrome b and control region sequences. J Anim Sci,86, pp. 2461-247.
52. Johnson, L.A. (1998). Current developments in swine semen: preservation, artificial insemination and sperm sexing. Proceedings 15th International Pig Vet Society, Birmingham, UK, 1:225-229.
53. Johnson, L.A., Weitze, K.F., Fiser, P. and Maxwell, W.M.C. (2000). Storage of boar semen. Anim. Reprod. Sci. 62:142-172.
54. Mayr E. (1982), Toward a new philosophy of biology. Observations of an Evolutionist. Harvard university press, london, England.
55. Keilin D. (1925). On cytochrome, a respiratory pigment, common to animals, yeast, and higher plants. Proc R Soc Lond B Biol Sci, 98, pp. 312-339.
56. Kim K. I., Lee J. H., Li K., Zhang Y. P., Lee S. S., Gongora J., Moran C. (2002).
Phylogentic relationships of Asian and European pig breeds determined by mitochondrial DNA D-loop sequence polymorphism. Animal Gentics, 33, pp. 1925.
57. King, G.J., Macpherson, J.W. (2005). Alkaline and Acid Phosphatase Activity, pH and Osmotic Pressure of Boar Semen. Can. J. Comp.Med. Vet. Sci., 30: 304-307. 58. Kingdon, J. (1997). The Kingdon Guide to African Mammals. Academic Press
Limited
59. Kommisrud, E., Paulenz, H., Sehested, E., Grevle, I.S. (2002). Influence of Boar and Semen Parameters on Motility and Acrosome Integrity in Liquid Stored for Five Days. Acta vet. scand., 43: 49-51;
60. Kruger T. F., (1993). The self teaching programme for strict sperm morphology. Bellville, South Africa, MQ Medical.
61. Kruska D. (1988). Mammalian domestication and its effect on brain structure and behavior. Pp. 211–50 in HJ Jerison and I Jerison (eds.) Intelligence and Evolutionary Biology. New York, NY: Springer-Verlag.
62. Kruska D. (1996). The effect of domestication on brain size and composition in the mink (Mustela vison). Journal of Zoology, London 239: 645–61.
63. Larsson, K. and Einarsson, S. (1976). Fertility ofdeep frozen boar spermatozoa. Acta vet. Scand. 17:43-62.
64. Lee, C.E. (2002). Evolutionary Gentics of Invasive Species. Trends in Ecology Evolution, 17, 386-391.
65. Long, J. L. (2003). Introduced Mammals of the World, their History, Distribution .
66. Lum K. J., McIntyre J. K., Greger D. L., Huffman K. W., and Vilar M. G. (2006).
Recent Southeast Asian domestication and Lapita dispersal of sacred male
pseudohermaphroditic‘‘tuskers’’ and hairless pigs of Vanuatu, PNAS, vol. 103, no. 46, pp. 17190–17195.
67. Macdonal, A. A. & Frädrich, H. (1991). Pigs and peccaries: what are they? In R. H. Barrett & F. Spitz (Eds.) Biology of Suidae. IRGM, Briançon, France, pp. 7-19. 68. Maillard, D. & Fournier, P. (1995). Effects of shooting with hounds on size of
resting range of wild boar (Sus scrofa L.) groups in Mediterranean habitat. Ibex, 3, 102–107.
69. Marion, F. (1982). Le Sanglier. Gerfaut Club, París.
70. Massei, G. & Genov, P. (2000). Il Cinghiale. Calderini Edagricole, Bologna.
71. Massei, G., Genov, P. V. & Staines, B. W. (1996). Diet, food availability and reproduction of wild boar in a Mediterranean coastal area. Acta Theriologica, 41, 307-320.
72. Mauget, R., Campan, R., Spitz, F., Dardallion, M., Janeau, G. & Pepin, D. (1984).
Synthéses des reconnais-sances actuelles sur la biologie du sanglier, perspectives de recherché. In: Symposium International Sur le Sanglier (Ed. by INRA), pp. 225. INRA, Toulouse.
73. Mazur, P. (1970). Cryobiology: the freezing ofbiological systems. Science. 168:939- 949
74. Morey DF. (1994). The early evolution of the domestic dog. American Scientist 82: 336–47.
75. Mortimer D, Menkveld R (2001). Sperm morphology assessment—historical perspectives and current opinions. Journal of Andrology, 22:192-205.
76. Nishizuka Y. (1995). Review: protein kinase C and lipid signaling for sustained cellular responses. The FASEB Journal, vol. 9, pp. 484-496.
77. Oliver W et al. (2015). Sus crofa. IUCN Red List of Threatened Species.
78. Ouithavon K. (2009). Molecular phylogentic relationships among Thai deer (subfamily Cervinae). A thesis for the degree of Doctor of Philosophy (Bioscience) Graduate School, Kasetsart University, Thailand.
79. Page R. D. M. and Holmes E. C. (1998). Molecular evolution: A phylogentic approach. Blackwell Science Ltd., London, chapter 2, 3, 5, 6, 8.
80. Panida C., Kampon K. and Padet K., (2011), Cryopreservation of Boar Semen by