Vi khuẩn phản ứng để thích nghi với các stress môi trường bằng cách kích
hoạt các cơ chế điều hòa khác nhau, bao gồm: tình trạng liên quan đến các hoạt
động chuyển hóa năng lượng; các hoạt động liên quan đến phiên mã và dịch mã; tình trạng liên quan đến chuyển hóa nucleotide và hoạt động sinh tổng hợp acid amin; và các hoạt động liên quan đến vách tế bào [170]. Quá trình thích ứng này
chủ yếu được thực hiện qua trung gian bởi sự kết hợp của mạng lưới điều hòa phiên
mã, cho phép vi khuẩn cảm nhận và chuyển đổi các kích thích ngoại bào (stress môi trường) thành một phản ứng tế bào cụ thể, dẫn đến thay đổi biểu hiện gen và hoạt động của các enzyme (truyền tín hiệu) (Hình 1.13).
Hình 1.13.Cơ chếđiều hòa phiên mã chống lại stress môi trường ở vi khuẩn Hüfner và cs. (2008) đã nghiên cứu đáp ứng phiên mã của L. reuteri với môi trường bột chua, kết quả cho thấy có những thay đổi đáng kể mức độ biểu hiện
Các thay đổi môi trường: Nhiệt độ, pH, áp suất thẩm thấu, kháng sinh Tồn tại & phát triển Sự biểu hiện của những gen đặc biệt DNA mRNA
Những thành phần chống lại điều kiện môi trường khắc nghiệt
38
mRNA của 101 gen liên quan đến các quá trình đa dạng tế bào, từ chuyển hóa
carbohydrate và năng lượng đến sinh tổng hợp vách tế bào, sản xuất EPS, phản ứng
stress, truyền tín hiệu và sinh tổng hợp cobalamin [171]. Tương tự, khi phân tích cơ chế phản ứng dung nạp acid của B. longum BBMN68, sau khi thích nghi với acid ở pH 4,5 trong 2 giờ, 293 gen của BBMN68 biểu hiện điều chỉnh tăng hơn 2 lần và 245 gen được điều chỉnh giảm hơn 2 lần ở pH gây chết (pH 3,5) trong 120 phút [172]. Wallet và cs. (2007) cũng tìm thấy sự khác biệt trong biểu hiện gen ở L. Reuteri ATCC55730 khi thay đổi pH môi trường gần với pH dạ dày của người [173].
Mối liên quan giữa stress môi trường với sự biểu hiện của các gen liên quan đến quá trình sinh tổng hợp EPS ở LAB cũng được ghi nhận ở một vài nghiên cứu.
Sự tăng biểu hiện của gen gtf 01207, một gen mã hóa cho priming
glycosyltransferase, được quan sát thấy trong B. animalis subsp. lactis sau khi tiếp
xúc với stress acid, muối mật và thẩm thấu [139,174]. Tương tự, một nghiên cứu
cho thấy khi pH môi trường giảm từ 6,5 xuống 5,5 đã làm tăng mức độ biểu hiện
của gen epsNMLKJ ở S. thermophilus ASCC 1275. Tuy nhiên, các gen liên quan
tổng hợp nucleotide-đường như dTDP-rhamnose và UDP-GlcNAc lại biểu hiện
giảm [175]. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng từ 37 lên 40 oC, không làm thay đổi mức
độ biểu hiện của epsNMLKJ nhưng sự biểu hiện của gen eps1C và eps1D tăng lên,
trong khi sự biểu hiện của gen eps2C và eps2D lại giảm [175].
Đánh giá sự biểu hiện của gen không chỉ dựa trên mRNA mà còn dựa vào
biểu hiện protein. Enzyme glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase (được chứng
minh cần thiết cho sản xuất EPS của Xanthomonas campestris pv. [176]) được biểu hiện dị hợp trong L. rhamnosus HN001 tăng nhẹ khi stress nhiệt. Trái lại, mức độ biểu hiện dị hợp của glyceraldehyd-3-phosphate dehydrogenase và phosphoglycerate kinase (liên quan đến sinh tổng hợp EPS của Xanthomonas axonopodis pv. Glycines [177]) giảm sau khi stress thẩm thấu [156].
Từ những đánh giá tổng quan có thể thấy rằng EPS từ LAB đa dạng về cấu
trúc cũng như thành phần và tính chất của chúng. Các yếu tố môi trường có ảnh
hưởng lớn đến hàm lượng, thành phần monosaccharide cũng như tính chất của các
EPS thu được. Trong luận án này, chủng L. plantarum được phân lập từ thực phẩm
39
CO2 đến quá trình tổng hợp EPS ở vi khuẩn này. Bên cạnh đó nghiên cứu cũng phân tích sự thay đổi thành phần monosaccharide và sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS nhằm làm sáng tỏ đáp ứng sinh tổng hợp EPS ở L. plantarum dưới điều kiện nuôi cấy có bổsung stress môi trường.
40
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu
Phạm vi của nghiên cứu được thực hiện trên chủng L. plantarum VAL6 tự phân lập.
Chủng vi khuẩn probiotic: L. acidophilus và B. longum được mua từ nhà sản xuất THT (Gembloux, Bỉ), trong khi L. plantarum được sử dụng là chủng L. plantarum VAL6 tự phân lập.
2.2. Hóa chất
Thành phần môi trường Man Rogosa Sharpe (MRS) nuôi cấy vi khuẩn [178]: Yeast extract 2%, Peptone 1%, Glucose 2%, NaCl 0,5%, K2HPO4 0,2%, MgSO4 0,02%, MnSO4 0,004%, Tween 80 0,1%.
Hóa chất khác: NaOH, H3PO4, CaCO3, (CH3CO)2O, ethanol 96%, DPPH, Trolox, Bovine serum albumin, Coomassie Brilliant Blue G250, Acid trifluoroacetic, hydroxylamin, pyridine, TRIzol, Bromochloropropane, Isopropanol.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Khảo sát ảnh hưởng của stress môi trường đến khảnăng sinh tổng hợp EPS ở L. plantarum
Stress pH Stress NaCl Tăng cường CO2
Stress nhiệt
Mẫu thực phẩm lên men
Phân lập, sàng lọc khảnăng sản xuất EPS và định danh
L. plantarum Xác định năng suất, hoạt tính sinh học của EPS và khả năng sống sót của vi khuẩn Phân tích hàm lượng protein và thành phần monosaccharide của EPS Phân tích sự biểu hiện mRNA của các gen liên quan tổng hợp EPS
41
Để xác định ảnh hưởng của các điều kiện stress môi trường lên quá trình sinh tổng hợp EPS, 100 mL dung dịch giống L. plantarum VAL6 sau khi tăng sinh (có OD595 = 1,5) được bổsung vào 5 L môi trường MRS lỏng. Các thí nghiệm được thực hiện trong bioreactor 5 L của hãng BIOSTAT (Sartorius Stedim, Germany).
Vi khuẩn được nuôi cấy ở điều kiện bình thường (pH luôn được duy trì ở 6,8 bằng
NaOH 10 M và H3PO4 10 M, nhiệt độ được giữ ở 37 oC, tốc độ khuấy được thiết lập là 250 vòng/phút) trong 24 giờ trước khi thực hiện các thí nghiệm gây stress.
2.3.1.1. Thí nghiệm stress nhiệt
Đểđánh giá ảnh hưởng của stress nhiệt lên khảnăng sinh tổng hợp EPS của
vi khuẩn L. plantarum VAL6, sau 24 giờ nuôi cấy ở điều kiện bình thường. Các nuôi cấy được xử lý ở nhiệt độ cao 42 và 47 oC trong 7 giờ. Thời gian được tính khi bioreactor đạt đến nhiệt độ gây stress cần thiết. Mẫu với thể tích 500 mL dịch nuôi
cấy được lấy theo các mốc thời gian 0, 1, 3, 5 và 7 giờ trong quá trình xử lý nhiệt
để định lượng EPS, mật số vi khuẩn, khảnăng sống sót sau sấy đông khô, tính chất
của EPS (hoạt tính chống oxy hóa, khả năng kích thích sự phát triển của vi khuẩn probiotic, hàm lượng protein), thành phần monosaccharide và sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS. Trong suốt quá trình stress nhiệt, pH luôn được duy trì ở 6,8 và tốc độ khuấy đảo là 250 vòng/phút. Thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
2.3.1.2. Thí nghiệm stress pH
Đểđánh giá ảnh hưởng của stress pH lên khảnăng sinh tổng hợp EPS của vi
khuẩnL. plantarum VAL6, sau 24 giờ nuôi cấy ở điều kiện bình thường. Các nuôi
cấy được xử lý ở pH 3 và 8 trong 7 giờ. Thời gian được tính khi bioreactor đạt đến
pH gây stress yêu cầu. Mẫu với thể tích 500 mL dịch nuôi cấy được lấy theo các mốc thời gian 0, 1, 3, 5 và 7 giờ trong quá trình xử lý nhiệt để định lượng EPS, mật số vi khuẩn, khả năng sống sót sau sấy đông khô, tính chất của EPS (hoạt tính chống oxy hóa, khảnăng kích thích sự phát triển của vi khuẩn probiotic, hàm lượng protein), thành phần monosaccharide và sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS. Trong suốt quá trình stress pH, nhiệt độluôn được duy trì ở 37 oC và tốc
độ khuấy đảo là 250 vòng/phút. Thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với 3 lần
42
2.3.1.3. Thí nghiệm stress NaCl
Đểđánh giá ảnh hưởng của stress NaCl lên khảnăng sinh tổng hợp EPS của
vi khuẩn L. plantarum VAL6, sau 24 giờ nuôi cấy ở điều kiện bình thường. Nuôi
cấy được xử lý gây stress bằng cách bổsung NaCl khan đểđạt nồng độ 10% (Nồng
độ muối 10% được lựa chọn dựa trên các thí nghiệm thăm dò). Mẫu với thể tích
500 mL dịch nuôi cấy được lấy theo các mốc thời gian 0, 1, 3, 5 và 7 giờ trong quá trình xử lý nhiệt để định lượng EPS, mật số vi khuẩn, khả năng sống sót sau sấy
đông khô, tính chất của EPS (hoạt tính chống oxy hóa, khảnăng kích thích sự phát
triển của vi khuẩn probiotic, hàm lượng protein), thành phần monosaccharide và sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS. Trong suốt quá trình stress NaCl,
nhiệt độluôn được duy trì ở 37 oC, pH là 6,8 và tốc độ khuấy đảo là 250 vòng/phút.
Thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
2.3.1.4. Thí nghiệm tăng nồng độ CO2
Thí nghiệm tăng nồng độ CO2 được thực hiện ởgiai đoạn đầu của nuôi cấy. Ngay khi chủng giống đầu tiên để nuôi cấy, CO2 được cung cấp liên tục với tốc độ 250 cm3/phút. Các nghiệm thức về thời gian tăng cường CO2 được mô tả ở bảng 2.2. Sau 24 giờ nuôi cấy theo quy định, mẫu với thể tích 500 mL dịch nuôi cấy
được lấy đểđịnh lượng EPS, mật số vi khuẩn, khảnăng sống sót sau sấy đông khô,
tính chất của EPS (hoạt tính chống oxy hóa, khả năng kích thích sự phát triển của vi khuẩn probiotic, hàm lượng protein), thành phần monosaccharide và sự biểu hiện của các gen liên quan tổng hợp EPS. Trong suốt quá trình nuôi cấy tăng cường CO2, nhiệt độ luôn được duy trì ở 37 oC, pH là 6,8 và tốc độ khuấy đảo là 250 vòng/phút. Thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại.
Bảng 2.1. Bố trí thí nghiệm nuôi cấy tăng cường CO2
Nghiệm thức Thời gian sục CO2 (giờ) Thời gian không sục CO2 (giờ) Tổng thời gian nuôi cấy (giờ) Đối chứng 0 24 24 Xử lý 4 giờ 4 20 24 Xử lý 8 giờ 8 16 24 Xử lý 24 giờ 24 0 24
43
2.3.2. Các phương pháp phân lập và tuyển chọn vi khuẩn L. platarum
2.3.2.1. Phân lập
Các mẫu thực phẩm lên men bao gồm củ kiệu muối chua (ký hiệu: CK), nước nho lên men (ký hiệu: L), dưa cải thảo muối chua (ký hiệu: DC), rau muống muối chua (ký hiệu: RM), cơm mẻ (ký hiệu: CC) và nem chua (ký hiệu: N) được mua từ chợ Long Xuyên, An Giang. Mẫu phân lập được chứa trong các túi lấy mẫu
PE vô trùng và được trữ lạnh ở 5 oC chờ phân tích. Mỗi mẫu có khối lượng 10 g
được pha loãng bằng nước muối sinh lý nồng độ 0,9% và trải trên môi trường thạch MRS có bổ sung CaCO3 vớinồng độ 5 g/L. Ủở 37 ºC trong 36 giờ. Chọn các khuẩn lạc làm tan CaCO3 để cấy truyền nhiều lần cho đến khi có được dòng vi khuẩn thuần [179]. Tất cả các chủng vi khuẩn sau khi tách ròng được bảo quản ở -20 °C
trong môi trường phân lập tương ứng có bổ sung thêm 30% (v/v) glycerol làm chất
bảo vệ tế bào. Tiến hành xác định các đặc điểm hình thái và sinh hóa (nhuộm Gram và hoạt tính catalase) của các dòng vi khuẩn phân lập được.
2.3.2.2. Kiểm tra khảnăng sản xuất EPS và định danh vi khuẩn
LAB từống giống được nuôi kích hoạt trong môi trường MRS lỏng trong 24 giờ ở 37 oC rồi cấy trải trên môi trường MRS agar. Chọn khuẩn lạc đơn trên đĩa thạch cấy chuyển vào 100 mL môi trường MRS lỏng để nuôi tăng sinh vi khuẩn trong 24 giờ ở 37 oC, lắc với tốc độ 150 vòng/phút.
Hút 1mL dung dịch LAB sau khi tăng sinh chuyển vào 100 mL môi trường MRS lỏng và ủở 37 oC trong 36 giờ, lắc với tốc độ 150 vòng/phút. Các mẫu sau khi nuôi cấy được mang đi xác định hàm lượng EPS theo phương pháp được mô tả ở mục 2.3.3. Chủng vi khuẩn sản xuất EPS cao nhất được định danh bằng phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA. Cặp mồi được sử dụng lần lượt là 27f
(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3’) và 1492r
(5’GGTTACCTTGTTACGACTT 3’) [180]. Kết quả giải trình tựđược so sánh mức
độ tương đồng di truyền trên ngân hàng dữ liệu của NCBI bằng công cụ Nucleotide
BLAST. Kiểm tra kích thước sản phẩm khuếch đại PCR của gen recA để khẳng định L. plantarum bằng cặp mồi planF (5’-CCGTTTATGCGGAACACCTA-3’) và
44
2.3.3. Phương pháp thu nhận EPS
Tổng EPS thô được thu nhận bằng cách trộn 100 mL dịch nuôi cấy với một
lượng NaOH đểđạt nồng độ 2 M và khuấy nhẹqua đêm ở nhiệt độ phòng (25 °C).
Sau đó, ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút để loại bỏ xác tế bào vi khuẩn và
lấy dịch trong ở phía trên. EPS thô được kết tủa bằng ethanol 96% (v/v). Quá trình
kết tủa được thực hiện ở 4 °C trong 24 giờ. EPS kết tủa trong ethanol được thu
hoạch bằng cách ly tâm ở 6000 vòng/phút trong 15 phút. Cuối cùng, EPS thô được sấy khô ở nhiệt độ55 °C cho đến khối lượng không đổi [162,182].
2.3.4. Các phương pháp phân tích tính chất của EPS thu được
2.3.4.1. Phương pháp xác định hoạt tính bắt gốc tự do DPPH
Hòa tan 0,1 g EPS vào 10 mL nước cất. Phản ứng được thực hiện bằng cách
bổ sung vào ống nghiệm 1,5 mL dung dịch EPS với 1,5 ml dung dịch DPPH 0,15
mM (được pha trong ethanol 96%). Ống đối chứng thay 1,5 mL dung dịch EPS
bằng 1,5 mL nước cất. Hỗn hợp được trộn đều và để yên trong bóng tối 30 phút ở
nhiệt độ phòng. Đo độ hấp thụ của hỗn hợp dung dịch ở 517 nm. Hoạt tính chống
oxy hóa được tính dựa vào đường chuẩn Trolox. Hoạt tính chống oxy hóa được
biểu thị bằng μmol Trolox tương đương (TE)/g EPS.
2.3.4.2. Phương pháp xác định hàm lượng protein trong EPS
Hàm lượng protein tổng trong EPS được xác định bằng phương pháp Bradford
[183]. Cân 0,1 g EPS, hoà tan và định mức lên 10 ml bằng nước cất. Hút 2 mL
thuốc thửBradford thêm vào 100 μL dung dịch EPS, trộn đều và ủ trong bóng tối
15 phút. Đo độ hấp thụở bước sóng 595 nm. Hàm lượng protein (mg/g EPS) được
tính dựa vào đường chuẩn Bovine serum albumin.
2.3.4.3. Phương pháp xác định khảnăng kích thích sự phát triển vi khuẩn probiotic của EPS
Sự phát triển của vi khuẩn probiotic (L. acidophilus, L. plantarum và B. longum được thực hiện trong môi trường MRS không đường được bổ sung 10 g/L các loại EPS khác nhau: EPSn (không gây stress); EPS42 (stress nhiệt ở 42 oC); EPS47 (stress nhiệt ở 47 oC), EPSpH3 (stress ở pH 3), EPSpH8 (stress ở pH 8), EPSNaCl (stress NaCl), EPSCO2 (tăng nồng độ CO2). Môi trường MRS bình
45
chủng vào 100 mL môi trường trường MRS lỏng để đạt mật số 106 CFU/mL. Ủ ở
37 °C với tốc độ lắc 150 vòng/phút trong 24 giờ, sau đó đếm mật số tế bào.
2.3.5. Phương pháp đếm mật số vi khuẩn và tính khảnăng sống sót sau đông khô
L. plantarum được đếm mật số trên môi trường MRS agar sau 48 giờ nuôi cấy ở 37 oC từ 3 nồng độ pha loãng liên tiếp. Sau khi ủ, chọn đĩa có số lượng khuẩn lạc 25 - 300 khuẩn lạc và đếm số khuẩn lạc có trên đĩa.
Số khuẩn lạc có trong mẫu được tính dựa theo công thức:
A (CFU/mL) = 𝑁
𝑛1𝑉𝑓1+𝑛𝑖𝑉𝑓𝑖
Trong đó: A là số tếbào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1 mL
mẫu; N là tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa đã chọn; ni là số lượng đĩa cấy
tại độ pha loãng thứ i; V là thể tích dịch mẫu (mL) cấy vào trong mỗi đĩa; fi là độ
pha loãng tươngứng.
Quá trình đông khô được thực hiện bằng cách ly tâm 10 mL dung dịch
huyền phù tế bào ở tốc độ 6000 vòng/phút trong 15 phút ở 4 oC để thu sinh khối tế bào. Tếbào được rửa 3 lần bằng nước muối sinh lý đã khửtrùng để loại các thành
phần môi trường. Tất cả các tế bào tiếp tục được làm đông lạnh đến -20 ◦C trước
khi đông khô.
- Khả năng sống sót sau đông khô (%) được tính bằng cách lấy mật số vi khuẩn còn sống sau sấy đông khô chia cho mật số vi khuẩn trước khi sấy đông khô (tức sau khi gây stress môi trường) rồi nhân với 100.
- Hệ số sống sót (SF) của L. plantarum VAL6 được tính bằng công thức sau [184]: SF = 1- (logCFUTrước sấy– logCFUSau sấy)/logCFUTrước sấy
logCFUTrước sấy= CFU/ml x Tổng thể tích mẫu (ml) trước đông khô.
logCFUSau sấy= CFU/g x Tổng trong lượng của mẫu vi khuẩn (g) sau đông khô.
Mối tương quan giữa tổng EPS và hệ số sống sót được chuyển đổi từ số liệu