FCS là phương pháp dựa trên tín hiệu của từng phân tử hoặc một số ít các phân tử. Để có thăng giáng tín hiệu huỳnh quang tối ưu, ngoài việc đáp ứng yêu cầu về sự ổn định của nguồn laze và độ nhạy cao của các đầu thu, thể tích đo là yếu tố rất quan trọng. Thể tích đo trong phương pháp FCS cần giảm xuống cỡ femto-lít để giảm số phân tử được quan sát. Trong phương trình đường tương quan, cần xác định các thông số cụ thể của thể tích đo (r0, z0) tương ứng với cấu hình hệ đã thiết lập. Xác định r0, z0 trực tiếp dựa trên quan sát vết hội tụ của laze tương đối phức tạp. Theo tài liệu tham khảo [168, 169], phương pháp đơn giản hơn để xác định r0, z0 là dựa vào thời gian khuếch tán D của một loại phân tử chất màu có hệ số khuếch tán D đã biết trước (sử dụng phương trình 1.17). Chất màu cần có hiệu suất lượng tử cao đảm bảo tín hiệu thu được đủ mạnh, có tính chất quang phù hợp với dải phổ của đối tượng cần nghiên cứu. Cấu hình hệ đo đã thiết lập với nguồn laze kích thích ở bước sóng 532 nm, hệ quang học và các đầu thu phù hợp để thu tín hiệu huỳnh quang tại vùng bước sóng trên 565 nm. Với cấu hình này, r0, z0 được xác địnhdựa vào dung dịch Rođamin B (RB) trong nước ở nồng độ rất loãng (< 10-7 M). Phân tử RB hấp thụ ánh sáng tại bước sóng 532 nm, cho tín hiệu huỳnh quang mạnh tại bước sóng max khoảng 580 nm (hình 3.4), hiệu suất lượng tử 0,5 trong etanol [170].
Hình 3.4. Phổ hấp thụ (đường đứt nét) và phổ huỳnh quang (đường liền nét) của RB trong nước.
Hình 3.5 trình bày đường tương quan huỳnh quang điển hình cho dung dịch RB ở 25oC đo trong 300s trên hệ FCS tự xây dựng trong luận án. Các đường thực nghiệm đều phù hợp với hàm lý thuyết G(τ) cho trường hợp khuếch tán thường của các phân tử (xem phương trình 1.14phần tổng quan):
Tiến hành khớp đường tương quan thực nghiệm với hàm tương quan lý thuyết G() theo phương pháp bình phương tối thiểu không tuyến tính thu được các giá trị thời gian khuếch tán D, số phân tử trung bình trong thể tích đo N = G(0) (bảng 3.2) và tỉ lệ hình học của thể tích đo = r0/z0.
Giá trị hệ số khuếch tán của RB ở 25oC theo tài liệu tham khảo là
(4,5 0,4) x 10-6 cm2s-1 [168]. Bán kính của thể tích quan sát r0, kích thước thể tích quan sát theo phương trục z0 và thể tích hiệu dụng Veff tính theo các phương trình 1.15 và 1.17 trình bày trong phần tổng quan. Các giá trị điển hình được trình bày trong bảng 3.3. Kết quả cho thấy giá trị của r0 xấp xỉ giới hạn nhiễu xạ (/2NA = 532 nm/2/1,25 213 nm), thể tích đo của hệ phù hợp với lý thuyết (cỡ femto-lít) và phù hợp với thông số của các hệ FCS tương tự trên thế giới [171].
Bảng 3.2. Các giá trị đo FCS cho RB
τD (μs) 36,0 0,7 N = 1/ G(0) 1,61 0,05 Nồng độ hiệu dụng (nM) 3,2 0,1
Bảng 3.3. Các thông số của thể tích đo
Thông số Hệ FCS trong luận án Tham khảo [171] ω = r0/z0 0,11 0,11 r0 (nm) 255 300 z0 (μm) 2,32 2,8 Veff (fl) 0,84 1,4