Các ADN sợi đơn có thể tạo thành sợi kép trong dung dịch. Sự hình thành sợi kép có thể được xác định nhờ sự giảm tính linh động của sợi ADN khi có liên kết. Để có thể khảo sát tương tác giữa hai oligonucleotide trong dung dịch bằng phép đo FCS, một trong hai sợi đơn cần đính phân tử phát quang. Sợi ADN phát quang được lựa chọn là một decamer oligonucleotide có đính phân tử chất màu AlexaFluor-555 (phân tử lượng MW = 4142,2 g/mol) tại đầu 5’ và có trình tự như sau:
5’-Alexa555-GGT GAA TGG G-3’
Sợi ADN bổ trợ cũng là một decamer oligonucletide có đính thêm phân tử biotin (không phát quang) tại đầu 5’, phân tử lượng MW = 3477,6 g/mol, có trình tự như sau:
5’-Biotin-TEG-CCC ATT CAC C-3’
Mục đích của phân tử biotin gắn kết ở một đầu của sợi là để tạo liên kết với streptavidin. Protein streptavidin (trọng lượng phân tử MW ~60 kDa) (hình 3.11) liên kết với biotin rất mạnh. Đây là một trong số các tương tác không phải là cộng hóa trị mạnh nhất hiện đã biết trong tự nhiên (hằng số phân li Kd cỡ 10-14 M). Streptavidin liên kết với biotin làm trọng lượng của sợi ADN tăng lên đáng kể. Vì hệ số khuếch tán tỉ lệ nghịch với căn bậc ba của trọng lượng phân tử [179], tức là D tăng khi trọng lượng phân tử tăng, nên gắn thêm phân tử streptavidin có thể giúp phân biệt sợi đơn phát quang và sợi kép dễ dàng hơn. Do đó, streptavidin được thêm vào dung dịch chứa ADN khi tiến hành đo đạc.
Hình 3.12 trình bày kết quả đo đạc tương tác của hai ADN trên hệ đo FCS đã xây dựng. Kết quả cho thấy đường tương quan thay đổi khi có mặt của ADN bổ trợ. Như vậy, đã xảy ra tương tác giữa ADN sợi đơn phát quang với ADN bổ trợ tạo thành sản phẩm là ADN sợi kép với thời gian khuếch tán dài hơn do có kích thước lớn hơn. Sự thay đổi này trở nên đặc biệt dễ quan sát khi có thêm tương tác giữa ADN sợi kép
Hình 3.11. a) Phân tử streptavidin liên kết với biotin; b) sợi ADN phát quang ở trạng thái tự do và khi kết hợp với sợi ADN bổ trợ
có gắn biotin liên kết với streptavidin.
và streptavidin. Đường tương quan cho ADN sợi đơn phù hợp với phương trình FCS cho khuếch tán của một phần tử phát quang (phương trình 1.14), trong khi các đường tương quan trong trường hợp có tương tác tạo thành ADN sợi kép không phù hợp với phương trình này. Các đường này chỉ có thể phân tích khi giả thiết có đóng góp đồng thời của hai thành phần với thời gian khuếch tán khác nhau: Thành phần thứ nhất là khuếch tán của sợi đơn ADN có gắn chất màu, D tìm được bằng thí nghiệm với mẫu chỉ gồm ADN sợi đơn. Thành phần thứ hai tương ứng với ADN sợi kép. Phương trình hàm tương quan có đóng góp của cả hai thành phần này như sau:
a)
𝐺(𝜏) = (1 − 𝑓) 1 + 1 + 𝜔 + 𝑓 1 + 1 + 𝜔 (3.1)
trong đó: τ1 , τ2tương ứng với thời gian khuếch tán của ADN sợi đơn phát quang và ADN sợi kép. τ1 được xác định nhờ kết quả đo đạc với dung dịch không chứa ADN bổ trợ.
f là tỉ lệ giữa số phân tử ADN phát quang đã phản ứng với ADN bổ trợ (chuyển thành ADN sợi kép) và tổng số phân tử ADN sợi đơn phát quang ban đầu.
là tỉ lệ hình học của thể tích đo.
N là số phân tử phát quang trung bình trong thể tích đo.
Hình 3.12. Đường tương quan huỳnh quang của ADN trước và sau khi đóng cặp.
1. ADN sợi đơn phát quang; 2. Hỗn hợp của ADN sợi đơn phát quang và ADN bổ trợ sau phản ứng ở nhiệt độ cao; 3. Hỗn hợp của hai ADN sau phản ứng ở nhiệt độ thường khi có mặt streptavidin; 4. Hỗn hợp của hai ADN sau phản ứng ở nhiệt độ cao khi có mặt streptavidin.
Phân tích các đường tương quan huỳnh quang cho các kết quả trình bảy ở bảng 3.6. Từ các kết quả này, có thể kết luận:
- Thời gian khuếch tán của ADN sợi đơn phát quang τ1 là 110 μs, của ADN sợi kép τ2 là 150 μs. Khi có streptavidin, thời gian khuếch tán của ADN sợi kép tăng lên đến 570 μs. Như vậy, tương tác giữa hai ADN đã thể hiện qua đo đạc FCS. Kết quả đo với sự hỗ trợ của streptavidin cho thấy sự khác biệt rõ rệt về đặc tính khuếch tán khi có tương tác giữa hai sợi ADN.
- Tiến hành kết hợp hai sợi đơn ADN ở nhiệt độ cao (95oC) hiệu quả hơn tại nhiệt độ phòng, thể hiện ở phần trăm ADN chuyển sang dạng sợi kép cao hơn (48% so với 30% tại nhiệt độ phòng).
Bảng 3.6. Kết quả đo đạc tương tác giữa ADN sợi đơn phát quang và ADN bổ trợ
Dung dịch Thời gian khuếch tán (μs) Phần trăm đã phản ứng (%) τ1 τ2
ADN sợi đơn phát quang 110 - - Hỗn hợp ADN sau phản ứng ở
nhiệt độ cao (95oC) 110 150 48 Hỗn hợp AND sau phản ứng ở
nhiệt độ phòng, có streptavidin 110 570 30 Hỗn hợp AND sau phản ứng ở
nhiệt độ cao (95oC), có streptavidin 110 570 48 Phản ứng giữa hai ADN sợi đơn tạo thành sợi kép có thể biểu diễn như sau:
(3.2) Hằng số phân ly KD của ADN sợi kép được tính theo công thức:
𝐾 =[𝐴] ∙ [𝐵][𝐴𝐵] (3.3)
𝑓 =[𝐴𝐵] + [𝐴] =[𝐴𝐵]
1
1 + 𝐾 /[𝐵] (3.4)
trong đó [AB] là nồng độ ADN sợi kép, [A] và [B] lần lượt là nồng độ ADN sợi đơn phát quang và nồng độ ADN bổ trợ sau phản ứng.
Trường hợp phản ứng ở nhiệt độ phòng 25oC: f = 0,3; [B] 3,0 M
KD = 7,0 M
Các kết quả cho thấy phương pháp FCS và hệ đo đã xây dựng trong luận án có tiềm năng ứng dụng trong nghiên cứu tương tác của các đối tượng sinh học.