Các nghiên cứu gần đây cho thấy, các elictor có tác dụng trong việc điều hòa biểu hiện gen tham gia vào chu trình sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp Sự tích lũy của các sản phẩm thứ cấp chính trong nuôi cấy tế bào thực vật tăng lên có liên quan đến mức độ biểu hiện của các gen cũng như tăng lên dưới tác dụng của các elicitor Chẳng hạn, các gen trong con đường
phenylpropanoid được kích hoạt biểu hiện và mức độ tích lũy furanocoumarin trong nuôi cấy tế bào cây rau mùi tây (Petroselinum crispum) [37] Park và cs (2016) đã nghiên cứu sử dụng YE và AgNO3 để tăng cường mức độ biểu hiện của các gen trong chu trình phenylpropanoid trong nuôi cấy tế bào cây hoắc hương núi (Agastache rugosa) Kết quả cho thấy xử lý YE 0,5 g/L và AgNO3 30
mg/L ở các thời điểm khác nhau đều làm tăng biểu hiện của các các gen trong chu trình phenylpropanoid và sự tích lũy của rosmarinic acid Mức độ biểu hiện của các gen RAS và HPPR tăng lên cao nhất là 1,84, 1,97 và 2,86 lần khi được xử lý YE ở các mốc thời gian 3, 6 và 12 giờ Đối với gen PAL, mức độ phiên mã tăng lên tới 52,31 lần khi xử lý bằng AgNO3 sau 24 giờ [91] Ngoài ra, một số nghiên cứu trước đây cũng cho thấy sự tăng biểu hiện của các gen khi được xử lý elicitor, ví dụ gen OsWRKY53 trong tế bào cây lúa khi xử lý cerebroside từ nấm [33], hay gen tham gia vào con đường tổng hợp phytosterol và
triterpene trong tế bào cây rau má (C asiatica) sau khi được xử lý bằng SA [68]
Kết quả trình bày ở bảng 3 10 và 3 12 cho thấy, sử dụng YE làm elicitor cho hiệu quả tốt hơn so với MeJA trong việc kích thích tăng khả năng tích lũy oleanolic trong tế bào cây đinh lăng lá nhỏ Bổ sung YE vào môi trường tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy đã ảnh hưởng đến sự tích lũy oleanolic acid của tế bào Ở môi trường bổ sung YE nồng độ 1 g/L, sinh tổng hợp oleanolic acid đã tăng 6,47 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor Ở công thức bổ sung YE nồng độ 3 g/L, hàm lượng oleanolic acid cũng cao gấp 2,5 lần so với đối chứng (Bảng 3 10) Như vậy, nồng độ YE khi bổ sung vào môi trường đã ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình tích lũy oleanolic acid
Đối với MeJA, hàm lượng oleanolic acid đạt cao nhất gấp 5,19 lần so với đối chứng khi bổ sung 100 µM vào ngày thứ 3 của quá trình nuôi cấy (Bảng 3 12) Theo một số nghiên cứu đã công bố, 100 µM MeJA được sử dụng khá phổ biến để tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp trong tế bào, tương tự như kết quả thu được của luận án, trong đó có sản xuất oleanolic acid
Wiktorowska và cs (2010) đã tăng cường khả năng sản xuất oleanolic acid từ nuôi cấy huyền phù tế bào cây Calendula officinalis Tác giả nhận thấy hàm lượng oleanolic thu được phụ thuộc vào nồng độ elicitor và thời điểm xử lý Sau 72 giờ xử lý với 100 µM MeJA, hàm lượng oleanolic acid thu được từ tế
bào đạt cao nhất (0,84 mg/g sinh khối khô), tăng 9,4 lần so với tế bào không xử lý elicitor [120] Krzyzanowska và cs (2012) đã bổ sung 100 µM MeJA vào môi trường nuôi cấy huyền phù tế bào cây Mentha piperita sau 7 ngày nuôi cấy để tăng cường khả năng sản xuất rosmarinic acid Kết quả chỉ ra rằng, hàm lượng rosmarinic acid đạt cực đại là 117,95 mg/g khô sau 24 giờ [57] Ở một nghiên cứu khác, Pourjabar và cs (2018) đã bổ sung 100 μM MeJA và 1 g/L YE vào môi trường nuôi cấy tế bào huyền phù cây Silybum marianum, các tác giả nhận thấy sự tích lũy silymarin tăng mạnh sau 48 giờ xử lý MeJA và YE [96]
Nhiều công trình nghiên cứu đã công bố cho thấy, sử dụng MeJA khá phổ biến trong việc tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp từ nuôi cấy tế bào thực vật Khi bổ sung MeJA vào môi trường nuôi cấy rễ tơ cây S vulgaris, khả năng tích lũy saponin triterpenoid trong rễ tơ có sự thay đổi đáng kể Lượng segetalic acid và gypsogenic acid cao gấp 5 và 2 lần tương ứng so với đối chứng [55] Nghiên cứu trên cây đinh lăng P filicifolia của Sliwińska và cs (2018) cho thấy, xử lý elicitor có thể làm tăng đáng kể hàm lượng các hợp chất phenol trong chồi và lá cây non, hàm lượng các chất chống oxy hóa thuộc nhóm flavonoid và hợp chất phenol thu được cao nhất khi xử lý với 200 μM MeJA [106] Manivannan và cs (2016) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các elicitor phi sinh học như MeJA, SA và sodium nitroprusside (SNP) đến khả năng tổng hợp các hợp chất chống oxy hóa và các hợp chất thứ cấp trong nuôi cấy tế bào Scrophularia kakudensis Trong đó, MeJA khi xử lý ở nồng độ từ 150-200 μM cho hiệu quả tổng hợp các hợp chất phenol và flavonoid là cao nhất [72]
So sánh hiệu quả khi xử lý các elicitor cho thấy, YE cho hiệu quả tốt hơn MeJA (Bảng 3 10 và 3 12) Kết quả này tương tự với một số nghiên cứu đã công bố trước đây Chẳng hạn, Linh và cs (2019) đã nghiên cứu sự tích lũy saponin (MR2, Rb1, và Rg1) trong rễ bất định cây sâm Ngọc Linh (P
vietnamensis), tác giả nhận thấy sự tích lũy saponin cao nhất khi được xử lý với 150 mg/L YE, cao hơn so với các loại elicitor khác như MeJA và SA [63] Khi nghiên cứu sản xuất L-Dopa từ nuôi cấy tế bào cây Mucuna pruriens, Raghavendra và cs (2011) nhận thấy 0,2 g/L YE có hiệu quả tốt nhất (62,35 mg/g), tiếp đến là 200 μM MeJA (45,93 mg/g), chitin và pectin có tác dụng ít hơn [98]
Việc sử dụng đồng thời cả MeJA và YE để tăng cường sản xuất hợp chất thứ cấp ở thực vật đã được thực hiện nhiều, trong phần lớn trường hợp, MeJA cho hiệu quả tốt hơn YE Rau má chứa nhiều loại triterpenoid như
madecassoside, asiaticoside, madecassic acid và asiatic acid, Baek và cs (2020) đã nuôi cấy rễ tơ cây rau má để tăng cường khả năng sản xuất các loại triterpenoid này Khi bổ sung MeJA và salicylic acid vào môi trường nuôi cấy, các tác giả nhận thấy không có sự khác biệt lớn về sinh trưởng của rễ tơ ở các nồng độ xử lý khác nhau Hàm lượng triterpenoid thu được cao nhất
(60,25 mg/g khối lượng khô) khi tác giả bổ sung 400 μM MeJA vào môi trường nuôi cấy [28]
Trong chu trình tổng hợp oleanolic acid ở thực vật, các gen đóng vai trò quan trọng là β-amyrin synthase (BAS) và CYP716A (Hình 1 4) [95] Hai gen oxidosqualene cyclase đáp ứng với MeJA (MeJA-responsive oxidosqualene cyclases) là ObAS1 và ObAS2 ở cây Ocimum basilicum đã được Misra và cs (2014) nghiên cứu Hai gen này mã hóa các chuỗi polypeptide dài 761 và 765 amino acid Chức năng của 2 enzyme này được xác định là tham gia xúc tác tổng hợp β-amyrin và α-amyrin, là tiền chất trực tiếp để sản xuất các triterpene dạng oleanane và ursane ObAS1 được xác định là β-amyrin synthase trong khi
ObAS2 là enzyme amyrin synthase xúc tác tổng hợp đồng thời cả -amyrin và α- amyrin [77] Do đó, Cơ chế tác động của MeJA trên cây đinh lăng lá nhỏ có thể cũng tương tự như ở cây Ocimum basilicum, đó là kích hoạt các gen xúc tác tổng hợp β-amyrin, là tiền chất để tổng hợp oleanolic acid
Thời điểm xử lý elicitor cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và tích lũy các sản phẩm thứ cấp của tế bào thực vật Trong nghiên cứu này, xử lý elicitor tại thời điểm bắt đầu nuôi cấy gây ra sự ức chế sự sinh trưởng của tế bào đinh lăng lá nhỏ, hàm lượng oleanolic acid thu được cũng thấp hơn các công thức xử lý khác Ở các mốc thời gian xử lý ngắn hơn, hàm lượng oleanolic acid thu được cao nhất thường rơi vào thời gian xử lý 3-6 ngày sau khi nuôi cấy Như vậy, thời gian xử lý elicitor trên cây đinh lăng lá nhỏ quá dài hoặc quá ngắn sẽ có hiệu quả thấp
Bên cạnh loại elicitor, thời gian xử lý elicitor thích hợp phụ thuộc vào khả năng đáp ứng của các loài thực vật khác nhau Yamamoto và cs (1995) đã chứng minh flavanone tích lũy trong callus của cây Sophora flavescens cao hơn mẫu đối chứng 5 lần khi bổ sung 2-8 mg/mL YE vào trong môi trường nuôi cấy ban đầu [123] Trong khi đó, Zhao và cs (2010) đã thu được một lượng tanshinone cao gấp 10 lần so với đối chứng từ nuôi cấy tế bào Salvia miltiorrhiza khi xử lý mẫu với 100 mg/L YE vào ngày thứ 18 của quá trình nuôi cấy [84] Nopo-Olazabal và cs (2014) nghiên cứu sản xuất stilbenoid ở rễ cây Vitis rotundifolia khi xử lý 100 µM MeJA hoặc 10 mM H2O2 trong 96 giờ Kết quả cho thấy, hàm lượng stilbenoid đạt cao nhất khi xử lý MeJA sau 12 giờ nuôi cấy [88] Nghiên cứu của Rahimi và cs (2014) chỉ ra rằng
sesquiterpene của P ginseng tích lũy cao nhất trong 24 giờ sau khi nuôi cấy rễ trong môi trường có bổ sung 200 µM SA [99] Trong nghiên cứu sản xuất paclitaxel từ nuôi cấy tế bào cây Corylus avellana của Salehi và cs (2019), hàm lượng paclitaxel thu được cao nhất khi bổ sung 10% (v/v) dịch chiết nấm
Chaetomium globosum vào môi trường nuôi sau 17 ngày nuôi cấy, cao hơn 4,1 lần so với đối chứng [102] Đối với cây đinh lăng lá nhỏ trong nghiên cứu này, thời gian xử lý elicitor tốt nhất rơi vào khoảng 1/3 thời gian của pha sinh trưởng, phù hợp với các nghiên cứu đã công bố trước đây
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Trong giới hạn nghiên cứu và các kết quả đạt được của đề tài, một số kết luận được rút ra như sau:
1 Môi trường cơ bản MS có bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/L KIN, 30 g/L sucrose và 9 g/L agar là tốt nhất cho khả năng sinh trưởng của callus thân cây đinh lăng lá nhỏ Khối lượng tươi và khô trung bình của
callus đạt lần lượt là 0,1239 g và 0,0088 g, tích lũy sinh khối khô tăng 23% so với đối chứng
2 Môi trường cơ bản MS có b ổ sung 1 mg/L BAP k ết h ợp v ới 0,5 mg/L 2,4-D, 20 g/L sucrose tốt nhất cho sự sinh trưởng của tế bào cây đinh lăng lá nhỏ, sinh kh ối khô đạt 0,45 g/bình, cao hơn khoảng 50% so v ới mẫu đối chứ ng
3 Sử dụng YE ở nồng độ 1 g/L bổ sung sau 6 ngày nuôi cấy cho hiệu quả tích lũy oleanolic acid cao nhất, gấp 6,47 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor (164,34 mg so với đối chứng 25,40 mg/g khối lượng khô) Sử dụng MeJA ở nồng độ 100 µM bổ sung sau 3 ngày nuôi cấy cho hiệu quả tích lũy oleanolic acid cao gấp gần 5,2 lần so với đối chứng không bổ sung elicitor (131,83 mg/g khối lượng khô)
KIẾN NGHỊ
Đề tài cần được tiếp tục nghiên cứu theo hướng ứng dụng, mở rộng ở quy mô pilot, từ đó hoàn thiện quy trình sản xuất oleanolic acid để có thể áp dụng vào sản xuất ở quy mô công nghiệp
CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1 , Nguyễn Thị Hà Ngân, Lê Thị Anh Thư, Lê Văn
Tường Huân (2018), “Ảnh hưởng của nguồn carbon và một số elicitor lên khả năng sinh trưởng của tế bào huyền phù đinh lăng (Polyscias fruticosa (L ) Harms)”, Tạp chí khoa học, Đại học Huế: Khoa học tự nhiên 127(1C): 85-94 DOI: 10 26459/hueuni-jns v127i1C 4922
2 Lê Văn Tường Huân, Lê Thị Anh Thư, (2020), “Ảnh
hưởng của một số yếu tố môi trường lên khả năng sinh trưởng của callus đinh lăng (Polyscias fruticosa (L ) Harms)”, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế 16(2): 135-143
3 Phan Thi A Kim, Le Thi Binh An, Nguyen Thanh Chung, Nguyen Tien Truong, Le Thi Anh Thu, Le Van Tuong Huan, Nguyen Hoang Loc (2020) “Growth and oleanolic acid accumulation of Polyscias fruticosa cell suspension cultures” Current Pharmaceutical Biotechnology 22(10): 1266- 1272 Doi: 10 2174/1389201021666201119123503
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1 Nguyễn Hồng Anh, Nguyễn Thị Phụng, Trần Chí Hải (2018), Khảo sát điều kiện bảo quản cao chiết ethanol từ lá đinh lăng Polyscias fruticosa (L ) Harm, Hội thảo khoa học khoa Công nghệ thực phẩm 2018 Trường đại học công nghiệp thực phẩm tp Hồ Chí Minh, tr 130-137
2 Huỳnh Thị Mai Duyên, Dương Thị Hồng Thắm, Trần Chí Hải (2018), Nghiên cứu quá trình trích ly saponin triterpenoid từ lá đinh lăng với sự hỗ trợ của dung môi, Hội thảo khoa học khoa Công nghệ thực phẩm 2018 Trường đại học công nghiệp thực phẩm tp Hồ Chí Minh, tr 81-88
3 Nguyễn Trung Hậu, Trần Văn Minh (2015), Nuôi cấy mô lá đinh lăng (Polyscias fruticosa L Harms) tạo rễ tơ và nhận biết hoạt chất saponin tích lũy, Tạp chí Khoa học Trường đại học An Giang, 7(1), tr 75-83
4 Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, quyển III, NXB Trẻ, TP Hồ Chí Minh
5 Hà Bích Hồng, Vũ Thị Thơm, Vũ Đức Lợi, Lê Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Hải (2013), Bước đầu xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây Đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L ) Harms), Tạp chí Dược học, 53(10)
6 Đào Duy Hưng, Lê Thị Hảo, Nguyễn Thị Hương Xiêm, Ngô Xuân Bình, Nguyễn Sinh Huỳnh (2017), Nhân giống in vitro cây đinh lăng lá nhỏ
(Polyscias fruticosa L Harms), Tạp chí Nông nghiệp & Phát triển Nông thôn,
8, tr 46-52
7 Bùi Văn Lệ, Nguyễn Ngọc Hồng (2006), Ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật và đường saccharose lên dịch nuôi cấy huyền phù tế bào dừa cạn (Catharanthus roseus), TC Phát triển Khoa học và Công nghệ, 9(6), tr 5- 66
8 Phạm Thị Tố Liên, Võ Thị Bạch Mai (2007), Bước đầu nghiên cứu sự tạo dịch treo tế bào cây Đinh lăng Polyscias fruticosa L Harms, Tạp chí phát triển Khoa học và Công nghệ, Trường ĐH KHTN, ĐHQG TPHCM, 10(7), tr 11-16
9 Phạm Văn Lộc, Nguyễn Thành Luân, Lương Thùy Ngân, Võ Thị Xuân An (2014), Nghiên cứu tạo rễ bất định cây Đinh lăng Polycias fruticosa (L ) Harms bằng phương pháp nuôi cấy in vitro, Tạp chí khoa học và công nghệ - Đại học Đà Nẵng, 3(76), tr 106-108
10 Nguyễn Hoàng Lộc (2011), Nuôi cấy mô và tế bào thực vật-Các khái niệm và ứng dụng, NXB Đại học Huế
11 Đỗ Tất Lợi (2005), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội
12 Ngô Ứng Long (1986), Cây Đinh lăng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 13 Nguyễn Thanh Mai, Nguyễn Quốc Khánh (2019), Nhân giống cây đinh lăng (Polyscias fruticosa (L ) Harms) trên hệ thống khí canh (Aeroponic) tự tạo, Tạp chí Khoa học Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, 14(1), tr 5-15 14 Đỗ Văn Mãi, Nguyễn Tấn Phát, Trần Công Luận (2019), Phân lập một số saponin từ lá cây Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L ) Harms), Tạp chí Nghiên cứu khoa học và Phát triển kinh tế Trường Đại học Tây Đô, 6, tr 181-189 15 Trịnh Việt Nga, Nguyễn Đức Minh Hùng, Phạm Thị Minh Tâm, Bùi Minh Trí, Ngô Thị Anh Khôi, Nguyễn Hữu Hổ (2017), Ảnh hưởng của nồng độ BA, IBA và NAA đến sự cảm ứng tạo phôi vô tính ở cây đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa (L ) Harms), Kỷ yếu Hội nghị sinh lý thực vật lần thứ hai (ISBN 978-604-60-2664-8), tr 226-234
16 Hà Thị Thanh Nga, Trương Bảo Nghi, Đỗ Hồng Phương Thảo, Trần Chí Hải (2019), Nghiên cứu quá trình trích ly saponin triterpenoid tổng từ lá đinh lăng với sự hỗ trợ của kỹ thuật siêu âm, Tạp chí Công thương, 22, tr 341-347 17 Trương Thị Bích Phượng, Văn Phú Trung, Nguyễn Đức Tuấn, Phạm Phú
Bình (2017), Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng trong nuôi cấy phát sinh hình thái in vitro Đinh lăng (Polyscias fruticosa (L ) Harms), Hội nghị khoa học khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 7, tr 1866-1872
18 Nguyễn Thị Thơ, Khuất Thị Hải Ninh, Vũ Thị Phan, Lê Viết Việt, Bùi Văn Thắng (2018), Nhân giống in vitro đinh lăng lá nhỏ (Polycias fruticosa
L Harms), Tạp chí khoa học và công nghệ lâm nghiệp, 4, tr 15-21
19 Tô Thị Nhã Trầm, Trương Phi Yến, Tôn Trang Ánh, Hoàng Thanh Tùng, Hà Thị Mỹ Ngân, Dương Tấn Nhựt (2020), Phát sinh phôi soma cây đinh lăng lá xẻ nhỏ (Polyscias fruticosa L Harms) thông qua nuôi cấy mẫu lá ex vitro, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 18(3), tr 497-506
20 Nguyễn Huỳnh Cẩm Tú, Trần Thị Ngọc Hà, Hoàng Văn Dương, Lê Tấn Đức, Lương Thị Yến, Phan Tường Lộc (2020), Ảnh hưởng của colchicine đến khả năng tạo tứ bội ở rễ tơ đinh lăng lá nhỏ (Polyscias fruticosa L Harms),
Báo cáo toàn văn Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2020, tr 941-946 21 Đỗ Tiến Vinh, Mai Thị Phương Hoa, Lê Thị Như Thảo, Nguyễn Hoàng Trang Nhã, Trần Văn Minh (2015), Sản xuất saponin bằng kỹ thuật nuôi cấy mô sẹo đinh lăng (Polyscisa fruticosa L Harms), Tạp chí Sinh học, 37(1se), tr 135-141