trưởng của callus
2 2 2 1 Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN
Callus (0,3 × 0,3 cm) có nguồn gốc từ lá, thân và rễ của cây đinh lăng lá nhỏ in vitro được nuôi trên môi trường cơ bản MS bổ sung 2,4-D có nồng độ từ 0,5-3 mg/L và 0,5 mg/L KIN để thăm dò khả năng sinh trưởng củ a callus [17, 21] Đối chứ ng là công th ứ c nuôi c ấy không b ổ sung KIN và 2,4-D S ố li ệu được thu sau 5 tu ần nuôi c ấy, t ừ đó rút ra nồng độ 2,4-D và KIN t ối ưu cho các nghiên cứ u ti ếp theo
Mẫu thí nghi ệm được cấy trong các bình tam giác có th ể tích 250 mL (ho ặc bình serum) ch ứa 50 mL môi trường r ắn, đặt trong phòng nuôi c ấ y có nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 2 000 lux, thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày [67] Số lượng callus/bình dao độ ng t ừ 10-12 mẫu
Sinh trưởng của callus được đánh giá dựa trên kích thước khối callus (đường kính), khối lượng tươi và khối lượng khô Trạng thái vật lý của callus được xác định bằng đánh giá cảm quan Callus sinh trưởng tốt nhất được dùng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm nuôi cấy huyền phù
Đường kính callus: được đo bằng thước kẹp
Khối lượng tươi (FW): Khối callus được loại bỏ agar, cân để xác định khối lượng tươi
Khối lượng khô (DW): Sau khi cân khối lượng tươi, callus được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô [67]
Chỉ số sinh trưởng (GI) được tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng tươi sau một thời gian nuôi cấy (g) và khối lượng tươi lúc đưa vào nuôi cấy (g)
2 2 2 2 Ảnh hưởng c ủ a ngu ồn nitơ
nhất, có các đặc điểm hình thái thích hợp để nuôi cấy tế bào huyền phù sẽ được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo
Mẫu callus (0,3 × 0,3 cm) được cấy lên môi trường cơ bản MS chứa các chất điều hòa sinh trưởng ở điều kiện tối ưu, bổ sung dịch tryptone (0, 2-1,6 g/L ) hoặc casamino acid s (0,2-1,6 g/L ) để thăm dò khả năng sinh trưởng của callus [21] Số lượng callus/bình dao động từ 10 - 12 mẫu Đối chứng là công thức nuôi cấy không bổ sung tryptone hoặc casamino acid s S ố liệu được thu sau 5 tuần nuôi cấy
2 2 3 Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy lên khả năng sinhtrưởng của tế bào trưởng của tế bào
Callus có màu vàng, rời rạc, 30 ngày tuổi từ công thức nuôi cấy tố t nhất được sử dụng cho các nghiên cứu nuôi cấy huyền phù tế bào Mẫu thí nghiệm được cấy trong các bình tam giác có thể tích 250 mL chứa 50 mL môi trường lỏng, đặt trong phòng nuôi cấy có nhiệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 500 lux, tốc độ lắc 120 vòng/phút và thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày [67] Mỗi công thức thí nghiệm gồm 5 bình
* X ây dựng đường cong sinh trưởng của tế bào: 2 g callus được cấy chuyển và nuôi trong bình tam giác chứa môi trường cơ bản MS lỏng (môi trường nuôi cấy tạo callus tốt nhất nhưng không có agar) với 30 g/L sucrose T ế bào được thu liên tục 2 ngày/lần trong thời gian từ 2-22 ngày, khả năng sinh trưởng của tế bào được xác định qua khối lượng tươi, khối lượng khô và chỉ số sinh trưởng của tế bào [86]
Thu mẫu : d ịch nuôi cấy tế bào huyền phù được lọc chân không, rửa sạch sinh khối bằng nước cất 2 - 3 lần sau đó được sử dụng làm nguyên liệu để đánh giá các chỉ tiêu liên quan
bằng giấy lọc, rửa bằng nước cất và cân để xác định khối lượng tươi Khối lượng khô (DW): callus được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, cân để xác định khối lượng khô [67]
Chỉ số sinh trưởng (GI) được tính bằng tỷ lệ giữa khối lượng tươi sau một thời gian nuôi cấy (g) và khối lượng tươi lúc đưa vào nuôi cấy (g)
* Khảo sát ảnh hưởng của nguồn carbon lên khả năng sinh trưởng của tế bào: trong thí nghiệm này sucrose được thay thế bằng đường glusose và fructose với các nồng độ 20-40 g/L , các điều kiện nuôi cây và các chỉ tiêu đánh giá được thiết lập dựa trên kết quả nghiên cứu tốt nhất thu được từ thí nghiệm trước đó Đối chứng là công thức sử dụng 30 g/L sucrose
* Khảo sát ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng lên sự phát triển của tế bào : môi trường cơ bản MS chứa nguồn carbon thích hợp từ thí nghiệm tr ước đã được sử dụng cho thí nghiệm này, các chất điều hòa sinh trưởng được sử dụng (cyt okinin và auxin) gồm BAP (0,5 -1,5 mg/L ) hoặc KIN (0,5 - 1,5 mg/L ) kết hợp với 2,4 -D (0,5-1 mg/L), các điều kiện nuôi cây và các chỉ tiêu đánh giá được thiết lập dựa trên kết quả nghiên cứu tốt nhất thu được từ thí nghiệm trước đó
2 2 4 Xử lý elicitor
Môi trường tích lũy sinh khối và oleanolic acid tốt nhất từ các thí
nghiệm trên được sử dụng để nghiên cứu khả năng sản xuất eloanolic acid từ tế bào có sử dụng các elicitor
Thí nghiệm nuôi cấy được tiến hành tương tự như đối với các thí
nghiệm nuôi cấy tế bào huyền phù Ảnh hưởng của các loại elicitor là YE và MeJA được đánh giá bằng cách bổ sung vào môi trường với các nồng độ elicitor khác nhau tại các thời điểm khác nhau (thời điểm ban đầu và sau 3, 6, 9 ngày nuôi cấy) Trong đó, MeJA có nồng độ từ 10-100 µM, YE từ 1-3 g/L
Mẫu thí nghi ệm được cấy trong các bình tam giác có th ể tích 250 mL chứa 50 mL môi trường l ỏng, đặt trong phòng nuôi c ấy có nhi ệt độ 25±2oC, cường độ chiếu sáng 500 lux, tốc độ lắc 120 vòng/phút và thời gian chiếu sáng 16 giờ/ngày [67] Mỗi công thức thí nghiệm gồm 5 bình
Sinh khối tế bào được thu hoạch sau 16 ngày nuôi để xác định khối lượng tươi, khối lượng khô và hàm lượng oleanolic acid Trong thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ elicitor, đối chứng là công thức không bổ sung elicitor Trong thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thời gian xử lý elicitor, đối chứng là công thức xử lý elicitor ở nồng độ tốt nhất vào thời điểm bắt đầu nuôi cấy (ngày 0)
2 2 5 Định lượng oleanolic acid
2 2 5 1 Tách chiết oleanolic acid
Mẫu (mẫu tự nhiên, tế bào huyền phù) sau khi xác định khối lượng tươi được sấy khô ở 50oC đến khối lượng không đổi, sau đó cân để xác định khối lượng khô [86] Mẫu khô sau đó được nghiền mịn và chiết với methanol (Merck, Đức) theo tỷ lệ 1 g bột mẫu: 5 mL methanol Hỗn hợp chiết được trộn đều và ủ ở 37oC trong 10 phút Hỗn hợp được phân làm hai lớp sau khi ủ, hút cẩn thận lấy dịch nổi phía trên, lặp lại 3 lần để thu dịch chiết tế bào Mẫu chiết được đem sấy ở 50oC qua đêm đến khi methanol bay hơi hết Tiếp theo bổ sung methanol với thể tích tương đương ban đầu để tái hòa tan oleanolic acid Dịch chiết oleanolic acid của tế bào thân đinh lăng lá nhỏ được lọc qua màng lọc 0,45 µm, bảo quản ở 4oC để sử dụng cho phân tích HPLC sau này
2 2 5 2 Phân tích HPLC
Hàm lượng oleanolic acid được xác định bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) theo Kochkin và cs (2014) [56]
và 0,1% acetic acid, với cột C18 (InertSustain C18 5 µm, 4,6×250 mm), nhiệt độ cột 24oC, tốc độ dòng 1 mL/phút, thể tích tiếp mẫu 5 µL Oleanolic acid được phát hiện ở bước sóng 210 nm Phân tích HPLC được tiến hành trên hệ thống sắc kí HPLC Shimadzu LC20A ( Shimadzu, Nhật Bản)
Tất cả dung môi đạt tiêu chuẩn phân tích HPLC được mua từ hãng Merck (Đức) Oleanolic acid của hãng Sigma được dùng làm chất chuẩn để xác định hàm lượng oleanolic acid (Bảng 2 1) Hàm lượng oleanolic acid được xác định dựa theo đường chuẩn xây dựng từ diện tích đỉnh (peak) của các nồng độ oleanolic acid chuẩn khác nhau trong phân tích HPLC
Phương trình đường chuẩn là: y = 3456x + 588,42 (R2 = 0,9966), trong đó: y là hàm lượng oleanolic acid (µg/mL), x là diện tích đỉnh
Hàm lượng oleanolic acid trong sinh khối khô được tính theo công thức: C (mg/g) = y V/(m 1000), trong đó: V là thể tích mẫu chiết (mL), m là khối lượng mẫu để chiết (g), 1000 là đơn vị quy đổi từ mg sang µg
2 2 6 Xử lý thống kê
Các thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên Thí nghiệm nuôi cấy callus được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 bình, mỗi bình chứa 10-12 mẫu callus Thí nghiệm nuôi cấy tế bào được lặp lại 3 lần, mỗi lần 5 bình Các thí nghiệm phân tích HPLC được lặp lại 3 lần Số liệu được xử lý bằng phương pháp thống kê sinh học, phân tích one-way ANOVA bằng Duncan’s test theo chương trình SPSS 22 0 với mức xác suất có ý nghĩa p<0,05
Callus (từ thân, rễ, lá)
Đánh giá khả năng sinh trưởng của callus
Lựa chọn loại callus và thiết lập nuôi cấy tế bào huyền phù
Đường cong sinh trưởng Ảnh hưởng của nguồn carbon Ảnh hưởng của chất ĐHST Sự tích lũy oleanolic acid Xử lý elicitor
(dịch chiết nấm men và methyl jasmonate)
Xác định sinh trưởng của tế bào
Xác định sự tích lũy oleanolic acid
Thu nhận oleanolic acid
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3 1 ẢNH HƯỞNG CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐẾN SINHTRƯỞNG CỦA CALLUS TRƯỞNG CỦA CALLUS
3 1 1 Ảnh hưởng của 2,4 - D kết hợp với KIN lên sinh trưởng của callus
Callus có nguồn gốc từ lá, thân và rễ của cây đinh lăng lá nhỏ in vitro
được cấy lên môi trường dinh dưỡng chứa 2,4-D và KIN để đánh giá khả năng sinh trưởng của callus Sự sinh trưởng của callus sau 5 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3 1-3 3
3 1 1 1 Callus có nguồn gốc từ lá
Callus có nguồn gốc từ mẫu lá của cây đinh lăng lá nhỏ được cấy lên môi trường cơ bản MS có bổ sung 2,4-D ở các nồng độ khác nhau (0-3 mg/L) kết hợp với 0,5 mg/L KIN để nghiên cứu khả năng sinh trưởng của callus, số liệu về sự sinh trưởng của callus sau 5 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3 1
Ở công thức đối chứng (không có bổ sung 2,4-D và KIN), kích thước trung bình của callus đạt 0,59 cm, khối lượng tươi trung bình đạt 76,7 mg, khối lượng khô trung bình đạt 0,0063 mg, callus có màu trắng ngả vàng, dạng trong, ngậm nước Khi bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng, khả năng sinh trưởng của callus tăng lên ở một số công thức nhưng giảm mạnh ở các công thức bổ sung nồng độ cao Môi trường cơ bản MS có bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết hợp với 0,5 mg/L KIN thích hợp nhất cho khả năng sinh trưởng của callus, kích thước trung bình của callus đạt 0,65 cm, khối lượng tươi và khối lượng khô trung bình của callus cao hơn so với các môi trường còn lại (129,9 mg và 9,3 g) Trên môi trường này callus có màu vàng tươi, dạng hạt nhỏ (Hình 3 1) Khi nồng độ 2,4-D tăng từ 1,5-5 mg/L thì khả năng sinh trưởng
của callus giảm dần Như vậy, môi trường cơ bản MS có bổ sung 1 mg/L 2,4- D kết hợp với 0,5 mg/L KIN là môi trường tốt nhất cho khả năng sinh trưởng của callus lá cây đinh lăng lá nhỏ
Bảng 3 1 Ảnh hưởng của 2,4-D kết hợp với KIN lên khả năng sinh trưởng
của callus lá sau 5 tuần nuôi cấy
Chất ĐHST (mg/L) Kích thước Khối lượng Khối lượng khô
2,4-D 0 0,5 1,0 1,5 2,0 3,0 KIN 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 (cm) 0,59ab 0,63a 0,65a 0,61a 0,53bc 0,50c tươi (mg) 76,7b 79,4b 129,9a 76,0b 61,3bc 41,3c (mg) 6,3bc 8,2ab 9,3a 6,1bc 5,2c 4,8c
Chú thích: Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p < 0,05 (Duncan’s test)
Hình 3 1 Callus lá sinh trưởng trên môi trường có bổ sung 1 mg/L 2,4-D kết
hợp với 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần nuôi cấy (bar = 1 cm)
3 1 1 2 Callus có nguồn gốc từ thân
Các mẫu callus có nguồn gốc từ thân của cây in vitro được cấy lên môi trường cơ bản MS có bổ sung 2,4-D kết hợp với KIN để nghiên cứu khả năng
sinh trưởng của callus Kết quả thu được sau 5 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3 2
Trong các môi trường nghiên cứu, môi trường cơ bản MS có 1 mg/L 2,4- D và 0,5 mg/L KIN cho kết quả tốt nhất, khối lượng tươi và khối lượng khô trung bình của callus đạt cao nhất (lần lượt là 123,9 mg và 8,8 mg) Callus có màu vàng tươi, dạng hạt nhỏ (Hình 3 2)
Ở các nồng độ 2,4-D thấp hơn hoặc cao hơn 1 mg/L, sinh trưởng của callus đều không tốt bằng Ở môi trường có 0,5 mg/L 2,4-D, khối lượng tươi chỉ đạt 107,2 mg (7,4 mg khô) Khi tăng nồng độ 2,4-D lên 1,5 mg/L, sinh trưởng thậm chí còn thấp hơn, khối lượng tươi chỉ đạt 79,7 mg, tương ứng với khối lượng khô là 6,3 mg
Bảng 3 2 Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN lên khả năng sinh trưởng của callus
thân sau 5 tuần nuôi cấy
ĐHST (mg/L) Kích thước Khối lượng Khối lượng khô 2,4-D 0 0,5 1 1,5 2 3 KIN 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 (cm) 0,66bc 0,71ab 0,73a 0,64c 0,61cd 0,58d tươi (mg/callus) 114,7b 107,2b 123,9a 79,7c 72,9cd 60,8d (mg/callus) 7,1bc 7,4b 8,8a 6,3bcd 5,9cd 5,0d
Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có mức ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05 (Duncan’s test)
Hình 3 2 Callus thân sinh trưởng trên môi trường có bổ sung 1 mg/L 2,4-D
và 0,5 mg/L KIN sau 5 tuần nuôi cấy (bar = 1 cm)
Ở môi trường đối chứng (MS cơ bản không có bổ sung 2,4-D và KIN), khối lượng tươi trung bình đạt 114,7 mg, khối lượng khô trung bình đạt 7,1 mg Callus có màu trắng và dạng hạt
3 1 1 3 Callus có nguồn gốc từ rễ
Khác với callus có nguồn gốc từ thân và lá, callus có nguồn gốc từ rễ được nuôi cấy duy trì trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 2 mg/L NAA và 0,5 mg/L KIN từ các nghiên cứu thăm dò trước đây, vì vậy, trong thí nghiệm này, ngoài công thức không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng, công thức này cũng được sử dụng như một công thức đối chứng Kết quả thu được sau 5 tuần nuôi cấy được trình bày ở bảng 3 3
Ở môi trường đối chứng, khối lượng tươi trung bình đạt 131,3 mg, khối lượng khô trung bình đạt 8,9 mg Callus có màu xanh, dạng hạt và hơi rắn (Hình 3 3) Trong các môi trường nghiên cứu kết hợp 2,4-D và KIN, môi trường cơ bản MS có 1,5 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L KIN cho kết quả tốt nhất, khối lượng tươi và khối lượng khô trung bình của callus đạt cao nhất (lần lượt là 105,3 mg và 8,1 mg) Tuy nhiên, sinh trưởng của callus thấp hơn môi
Bảng 3 3 Ảnh hưởng của 2,4-D và KIN lên khả năng sinh trưởng của callus
rễ sau 5 tuần nuôi cấy
ĐHST (mg/L) 2,4-D KIN ĐC Kích thước (cm) 0,72a
Khối lượng tươi (mg/callus) 131,3a Khối lượng khô (mg/callus) 8,9a 0 0,5 1 1,5 2 3 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,64bc 0,66b 0,69ab 0,70ab 0,64bc 0,61c 90,7c 96,3c 102,8b 105,3b 82,5d 70,7e 7,3c 7,6bc 7,8b 8,1b 6,9cd 6,1e
Các chữ cái khác nhau trên cùng một cột chỉ ra sự sai khác có mức ý nghĩa thống kê của trung bình mẫu với p<0,05 (Duncan’s test) ĐC: Callus được cấy trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 2 mg/L NAA và 0,5 mg/L KIN
Hình 3 3 Callus rễ sinh trưởng trên môi trường có bổ sung 2 mg/L NAA và
Ở các nồng độ 2,4-D thấp hơn hoặc cao hơn 1,5 mg/L, sinh trưởng của callus đều không tốt bằng Ở môi trường có 1 mg/L 2,4-D, khối lượng tươi chỉ đạt 102,8 mg (7,8 mg khô) Khi tăng nồng độ 2,4-D lên 2 mg/L, sinh trưởng của callus giảm mạnh, khối lượng tương chỉ 82,5 mg, tương ứng với khối lượng khô là 6,9 mg
Từ các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, sau 5 tuần, sinh trưởng của các loại callus có nguồn gốc khác nhau có sự sai khác không đáng kể Callus có nguồn gốc từ lá có màu vàng tươi, dạng hạt nhỏ, hơi mọng nước, sinh trưởng kém nhất trong 3 loại Callus có nguồn gốc từ thân có màu vàng, dạng hạt rời rạc, phù hợp để nuôi cấy huyền phù tế bào Callus có nguồn gốc từ rễ có màu