2.2.1. L họ v thẩ đị h hươ g há đị h lượ g etfor i
- Lựa chọn phương pháp: tiến hành khảo sát và lựa chọn ra phương pháp phù hợp với điều kiện thí nghiệm.
- Thẩm định phương pháp: tiến hành thẩm định đầy đủ phương pháp định lượng đã lựa chọn theo hướng dẫn của TT quy định về đăng k thuốc, Số 44/2014//TT-BYT bao gồm các ch tiêu:
+ Ảnh hưởng của giấy lọc + Tương thích hệ thống + Độ đặc hiệu
+ Tính tuyến tính + Độ đúng
+ Độ chính ác
2.2.1.1. Ảnh hưởn ủa iấy lọ
Yêu cầu của phép thử độ hòa tan: Thiết bị (giấy) lọc phải trơ, hấp thụ không đáng kể hoạt chất trong mẫu, không chứa các chất có thể bị chiết ra bởi môi trường hoà tan gây trở ngại cho qui trình phân tích đã ch dẫn, và có cỡ lỗ ốp thích hợp. Chứng minh giấy lọc không ảnh hưởng đến quy trình phân tích.
Phương pháp thử:
Dung dịch chuẩn được chia làm 4 phần: 1. Không lọc
2. Lọc qua giấy lọc thường 3. Lọc qua giấy lọc Whatman
4. Lọc qua màng lọc 0,45 µm
PP HPLC: sắc k 4 dd trên, ác định diện tích đ nh
PP Quang phổ: đo độ hấp thu của 4 dung dịch trên
Yêu ầu: sự sai khác về diện tích đ nh (độ hấp thu) giữa các dd với dd không lọc < 2%
2.2.1.2. ư n h h h h n
- HPLC: Tiêm > 6 lần và đánh giá các thông số sắc k . - UV-vis: đo độ hấp thu của dd chuẩn 6 lần
Yêu ầu: RSD < 2%
2.2.1.3. Độ đặ hi u (Specificity/selectivity)
Mụ đ h: Tính đặc hiệu của một quy trình phân tích nhằm chứng minh quy trình phân tích cho phép ác định chính ác và đặc hiệu chất cần phân tích mà không bị ảnh hưởng bởi sự có mặt của các chất khác có trong mẫu thử, phân biệt chất phân tích với nền mẫu và với các chất khác (tạp chất, sp phân hủy, chất nền).
Cá h iến hành: Tiến hành phân tích các loại mẫu sau đây theo phương pháp đã ác định:
- Mẫu trắng: Dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu.
- Mẫu chuẩn (hỗn hợp chuẩn) - Mẫu thử
- Mẫu thử thêm chuẩn: mẫu đã được cho thêm chuẩn nồng độ ác định. + PP HPLC: sắc k 5 dd trên, ác định thời gian lưu và diện tích đ nh ( với đầu dò PDA cần ác định thêm độ tinh khiết pic)
+ PP Quang phổ: đo độ hấp thu của 5 dung dịch trên
2.2.1.4. nh uyến tính
Định nghĩa: Là khả năng của quy trình (trong khoảng ác định) thu được kết quả thử tỷ lệ trực tiếp đến nồng độ chất phân tích trong mẫu thử.
Phương pháp:
+ Pha loãng giai mẫu từ nồng độ mẹ hoặc cân riêng biệt từng nồng độ Yêu cầu: Correlation coefficient (r) ≥ 0,99 Xét tính thích hợp của phương trình hồi quy
Xét tính tương thích của phương trình tuyến tính bằng test F và nghĩa các hệ số bằng test t.
2.2.1.5. Độ đún
Định nghĩa: mức độ sát gần của các giá trị tìm thấy với giá trị thực khi áp dụng qui trình đề uất trên cùng một mẫu thử đã được làm đồng nhất / cùng điều kiện ác định
- Độ đúng của phương pháp: biểu thị bằng tỷ lệ hồi phục - Tỷ lệ hồi phục càng gần 100%, độ đúng càng tốt.
Yêu ầu: Tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ: 95- 105%, RSD tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ ≤ 5%
2.2.1.6. Độ h nh xá
Độ chính ác Cho biết mức độ sát gần giữa các kết quả thử riêng rẽ i với giá trị trung bình X thu được khi áp dụng phương pháp đề uất cho cùng một mẫu thử đồng nhất trong cùng điều kiện ác định, gồm:
- Độ lặp lại:
+ Thử trên 6 mẫu thử độc lập trong cùng ngày
+ Xác định lượng hoạt chất đã hòa tan, so sánh với dung dịch chuẩn hoặc phương trình hồi quy tuyến tính
+ Xác định RSD % kết quả hoạt chất đã hòa tan trong các mẫu
Yêu ầu: RSD < 6% (tùy theo chuyên luận cụ thể)
- Độ chính ác trung gian: Tiến hành như độ lặp lại nhưng khác ngày, khác kiểm nghiệm viên, khác thiết bị.
Yêu ầu: RSD < 6% (tùy theo chuyên luận cụ thể).
2.2.2. á h giá tươ g đươ g hò t i vitro giữ Glu ofi e v Glucophage
Tiến hành theo hướng dẫn chung trong hướng dẫn thử TĐSH của ASEAN, phương pháp thử độ hòa tan ghi trong tiêu chuân cơ sở của thuốc nghiên cứu và
các hướng dẫn của FDA Mỹ. Xác định hệ số tương đồng f, của hai chế phẩm ở từng môi trường hòa tan. Hai chế phẩm tương đương hòa tan nếu f, đạt trên 50.
Đánh giá sự tương đương dựa trên điều kiện của:
- Tối thiểu 3 điểm lấy mẫu (không bao gồm điểm không) - 12 giá trị cho mỗi điểm lấy mẫu của mỗi thuốc.
- Không quá 1 giá trị trung bình > 85% hòa tan cho mỗi thuốc
- Độ lệch chuẩn của trung bình của bất kỳ thuốc nào cần phải nhỏ hơn 10% từ điểm thứ 2 đến điểm cuối cùng.
- Giá trị f2 = 50 – 100 gợi cho thấy rằng 2 biểu đồ hòa tan là tương tự. Trong trường hợp nếu trên 85% của cả hai thuốc được hòa tan trong vòng 15 phút, biểu đồ hòa tan có thể được chấp nhận tương tự nhau mà không cần phải đánh giá thêm.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ V B N U N
Qua nghiên cứu của Phan Quỳnh Lan và cộng sự (Trường đại học y dược Hà Nội – 2010), cho kết quả như sau:
3.1. Thuốc nghiên c u
- Chế phẩm thử. viên nén bao phim glucofine 850mg, do Domesco sản xuất, SĐK: VD-0623-06, số lô 210907, NSX: 09/2007, HSD: 09/2010.
- Chế phẩm đối chiếu: viên nén bao phim glucophage 850mg, do Merck Santé s.a.s (Pháp) sản xuất, SĐK VN-1928-06, số lô 106951, NSX: 07/2006, HSD: 07/2011.
Các lô thuốc của hai chế phẩm đưa vào nghiên cứu đều có phiếu kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn về định lượng, độ đồng đều khối lượng, độ hoà tan theo tiêu chuẩn qui định.
3.2. Nghiên c u tƣơng ƣơng in vitro (thử nghiệm ộ hòa tan)
Thử nghiệm độ hòa tan của hai chế phẩm được thực hiện với thiết bị loại l (giỏ quay), tốc độ 100 vòng/phút, ở ba môi trường có pH 1,2; 4,5 và 6,8; thể tích và nhiệt độ môi trường hòa tan tương ứng là 900 ml và 37°C + 0,5 °C.
Ở mỗi môi trường, thử nghiệm được thực hiện song song với 12 viên thuốc của mỗi chế phẩm thử hoặc đối chứng.
Lấy dịch hòa tan tại các thời điểm nhất định (5, 10, 15 và 20 phút), lọc và định lượng metformin hydrochlorid trong môi trường hoà tan bằng phương pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến ở bước sóng 233 nm.
Phương pháp phân tích đã được thẩm định với các ch tiêu độ đúng: độ chính xác; giới hạn định lượng; độ lặp lai trong ngày và khác ngày; khoảng tuyến tính
3.2.1. Kết quả đá h giá tươ g đươ g i vitro giữa thu c nghiên cứu và thu đ i chiếu:
Bảng 3.9. Độ hòa tan metformin HCl trong 3 môi trường hòa tan (n = 12)
Dƣợc chất Thời iểm Thuốc nghiên c u Thuốc ối chiếu
% TB hòa tan RSD (%) % TB hòa tan RSD (%)
Metformin Hydroclorid (pH 1,2) 5 phút 32,19 6,37 30,53 9,11 10 phút 48,12 2,23 50,34 6,26 15 phút 88,84 3,49 89,38 5,25 20 phút 97,14 2,83 100,27 4,37 So sánh f2 = 87,50
Dƣợc chất Thời iểm Thuốc nghiên c u Thuốc ối chiếu
% TB hòa tan RSD (%) % TB hòa tan RSD (%)
Metformin Hydroclorid (pH 4.5) 5 phút 32,26 3,28 28,02 5,11 10 phút 47,53 1,85 47,71 5,20 15 phút 85,97 4,85 86,02 4,46 20 phút 99,42 3,87 102,99 2,41 So sánh f2 = 91,95 Dƣợc chất Thời iểm
Thuốc nghiên c u Thuốc ối chiếu
% TB hòa tan RSD (%) % TB hòa tan RSD (%)
Metformin Hydroclorid (pH 6,8) 5 phút 31,43 6,48 28,51 7,48 10 phút 47,93 7,55 46,59 5,91 15 phút 85,55 5,32 85,63 6,61 20 phút 97,27 1,72 99,20 2,95 So sánh f2 = 93,19
3.2.2. So sá h đ hòa tan của thu đ i chiếu và thu c nghiên cứu
Việc tiến hành đánh giá tương đương in vitro thuốc nghiên cứu với thuốc đối chiếu trên cả ba môi trường pH 1,2; 4,5 và 6,8 và định lượng hoạt chất bằng phương pháp quang phổ đã được thẩm định. Từ kết quả thực nghiệm, cho thấy: Hệ số tương đồng f2 của hai chế phẩm trong 3 môi trường pH 1,2; 4,5 và 6,8 lần lượt là 87.5; 91,95 và 93,19 (tất cả đều lớn hơn 50). Ngoài ra, ở tất cả các thời điểm lấy mẫu, RSD đều không quá 10% theo quy định trong hướng dẫn của ASEAN/FDA.
Như vậy, chế phẩm viên nén bao phim glucofine 850mg và viên nén bao phim glucophage 850mg được em là tương đương in vitro trong cả ba môi trường hòa tan pH 1,2; 4,5 và 6,8.
Ngoài ra, khi sử dụng công cụ f2 để so sánh khả năng phóng thích metformin hydroclorid trên 3 cặp môi trường, nhận thấy chế phẩm nghiên cứu phóng thích metformin hydroclorid không phụ thuộc vào các môi trường hòa tan, cho phép thuốc được hấp thu suốt theo chiều dài ống tiêu hóa.
Tóm lại, từ kết quả độ hòa tan, có thể dự đoán mô hình phóng thích hoạt chất của chế phẩm nghiên cứu và thuốc đối chiếu trong ống tiêu hóa là tương tự nhau, làm cơ sở ban đầu cho sự tương đồng trong quá trình hấp thu thuốc vào máu để đạt hiệu quả trị liệu của thuốc nghiên cứu với thuốc đối chiếu.
KẾT U N
Nghiên cứu đánh giá độ hòa tan có thể được thực hiện nhằm hai mục đích: đảm bảo chất lượng và đánh giá thay thế cho thử TĐSH in vivo.
Chính vì vậy, trong bước đầu tiên đề đảnh giá so sánh chất lượng của Glucofine và Glucophage, thử nghiệm so sánh độ hòa tan của hai chế phầm đã được thực hiện. Kết quả cho thấy, ở ba môi trường có pH khác nhau, cả hai chế phẩm đều hòa tan nhanh (trên 85% hoạt chất hòa tan trong vòng 15 phút), hệ số tương đồng f2 đều đạt giá trị lớn hơn 50, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của tỷ lệ hòa tan tại mỗi thời điểm đều <10%. Như vậy, chế phẩm thử tương đương in vitro với chế phẩm đối chiếu.
Theo hệ thống phân loại sinh dược học, metformin là hoạt chất thuộc nhóm 3 “có độ hòa tan cao, khả năng thẩm qua màng thấp". Hướng dẫn của ASEAN cho phép các thuốc nhóm 3 được xem xét miễn thử in vivo nếu cả chế phẩm thử và đối chiếu có độ hòa tan rất nhanh và độ hòa tan của chế phẩm thử tương đương với chế phẩm đối chiếu ở cả 3 môi trường pH 1,2; 4,5 và 6,8 (f2 > 50).
Trong nghiên cứu này, cả chế phẩm thử và đối chiếu đều có độ hòa tan rất nhanh ở cả ba môi trường tiến hành thử nghiệm (có trên 85% hoạt chất hòa tan trong vòng 15 phút). Như vậy căn cứ vào yêu tố độ hòa tan, Glucofine được xem xét miễn thử in vivo theo hướng dẫn của ASEAN và không nhất thiết phải tiến hành đánh giá TĐSH in vivo./.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Phan Quỳnh Lan, Hoàng Kim Huyền, Vũ Đình Hòa, Nguyễn Tứ Sơn (2008), Xác định nồng độ metforrmin trong huyết tương người bằng HPLC, Tạp chí Dược học, số 385, trang 27-31, 44.
2. Phan Quỳnh Lan, Hoàng Kim Huyền, Đỗ Trung Quân, Đỗ Thị Nguyệt Ánh, Trịnh Trung Hiếu (2009), Đánh giá hiệu quả của Glucofine trong điều trị đái tháo đường typ 2, Tạp chí Dược học, số 396, trang 14-18. 3. Phan Quỳnh Lan, Hoàng Kim Huyền, Nguyễn Tứ Sơn, Trịnh Trung Hiếu
(2010), Đánh giá tương đương in vitro và tương đương sinh học in vivo của chế phẩm metformin, Tạp chí Dược học, số 408, trang 7- 10.
4. Thông tư số: 32/2018/TT-BYT, ngày 12 tháng 11 năm 2018 của bộ trưởng bộ y tế về Quy định việc đăng k lưu hành thuốc, nghuyên liệu làm thuốc.
5. Phụ lục II – Thử nghiệm độ hòa tan – Hướng dẫn nghiên cứu BA/BE-1 6. Phụ lục V - Hướng dẫn thực hiện nghiên cứu tương đương sinh học