Các protein của virus dại đều cĩ tính kháng nguyên, nhưng chúng khơng cĩ vai trị như nhau trong miễn dịch. Protein G là kháng nguyên đặc hiệu dại duy nhất là nơi tiếp xúc đầu tiên với tế bào chủ và kích thích cơ thể sinh ra kháng thể trung hịa virus một cách ổn định. Chúng tạo thành những chồi gai ở bề mặt của virus và chính các gai này làm cho virus cĩ tính đặc thù và tính sinh miễn dịch trong quá trình lây nhiễm. Tính chất này phụ thuộc chủ yếu vào sự tồn tại của cấu trúc khơng gian 3 chiều mặc dù vị trí trung hịa trực diện bậc 1 đã được xác định. Mặt khác, protein G cịn chia sẻ khả năng sinh miễn dịch tế bào cĩ liên quan đến tế bào T trợ giúp, tế bào T gây độc đối với protein N và M1. Đáp ứng miễn dịch của tế bào T cĩ vai trị quan trọng trong đáp ứng miễn dịch với bệnh dại. Các nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các protein G là kháng nguyên quan trọng nhất và cần thiết phải cĩ mặt trong vaccine (Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Nguyễn Thị Kiều Anh, 2014).
Theo Tordo (1996), ngồi kháng nguyên G, cịn cĩ protein N nằm ở phần lõi virus cũng rất quan trọng bởi 2 nguyên nhân: khả năng kích thích tế bào T hỗ trợ trong đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào khi tiêm vaccine dại; ít bị biến đổi hơn so với các kháng nguyên khác. Điều này chỉ ra rằng protein N là kháng nguyên tốt nhất để làm tăng sự bảo vệ của vaccine đối với các dịng virus dại. Khi bị nhiễm virus dại hoặc sử dụng vaccine, kháng nguyên sẽ kích thích cơ thể sinh đáp ứng miễn dịch đặc hiệu bao gồm đáp ứng miễn dịch dịch thể và miễn dịch tế bào (Đỗ Quang Hà, 2005).
Đáp ứng miễn dịch dịch thể: đáp ứng miễn dịch dịch thể liên quan chủ yếu đến kháng thể trung hịa virus thơng qua cơ chế bảo vệ bằng phản ứng trung hịa virus ngoại bào, phản ứng kết hợp bổ thể qua trung gian tế bào bị nhiễm virus và gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể. Kháng thể trung hịa virus gồm 2 lớp IgG và IgM. Chúng cĩ khả năng gián tiếp loại bỏ hồn tồn virus dại ra khỏi hệ thần kinh trung ương mà khơng cần tới sự trợ giúp của các hiệu ứng miễn dịch khác.
Đáp ứng miễn dịch tế bào: miễn dịch qua trung gian tế bào chưa được nghiên cứu đầy đủ ở người, nhưng người ta đã nhận biết được rằng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào cĩ liên quan tới các tế bào T - trợ giúp (T - help cells) và các tế bào T - gây độc (Cytotoxic T cells), đáp ứng miễn dịch này cĩ một vai trị quan trọng trong cơ chế chống lại virus dại. Sự lây nhiễm virus dại sẽ kích thích cơ chế tạo ra các tế bào T-CD4 và T-CD8 đặc hiệu. Protein G của virus xuất hiện và trở thành kháng nguyên chủ yếu trong đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào T gây độc và là mục tiêu của nĩ. Vai trị của tế bào T-CD8 trong hàng rào miễn dịch chống virus dại chưa được biết rõ ràng. Người ta chỉ biết rằng virus dại sẽ được thải trừ sau khi chuyển virus dại với tế bào T đặc hiệu virus dại và bảo vệ được chuột chống lại virus dại bằng dịng lympho bào T gây độc tế bào (CTL), cĩ khả năng tấn cơng trực tiếp và gây độc cho các tế bào đích mang các kháng nguyên virus đặc hiệu trên bề mặt.
Bên cạnh đĩ nucleocapsid của virus dại cũng là 1 kháng nguyên quan trọng kích thích cơ thể động vật tạo ra tế bào CD4 và chủ yếu các tế bào T này cĩ phản ứng chéo với các Lyssavirus khác. Tế bào T đặc hiệu ribonucleoprotein làm tăng khả năng tạo ra kháng thể trung hồ virus qua cơ chế nhận dạng kháng nguyên trong cấu trúc và được coi là yếu tố cơ bản trung gian trong đáp ứng miễn dịch bảo vệ. Việc phát hiện kháng thể ở người bị bệnh dại sau khi xuất hiện triệu chứng lâm sàng hoặc chết khơng cịn cĩ giá trị chẩn đốn vì quá muộn. Xác định hiệu giá kháng thể được coi là dấu hiệu chỉ điểm, thường được sử dụng để đánh giá trạng thái miễn dịch sau khi tiêm vaccine.
2.1.7 Sức đề kháng
Theo Hồ Thị Việt Thu (2014), virus cĩ sức đề kháng yếu với nhiệt độ, ở 50oC virus bị tiêu diệt sau 15 phút, ở 100oC virus bị tiêu diệt sau 2 phút. Virus bị tiêu diệt nhanh chĩng bởi ánh sáng, tia X, tia tử ngoại. Ánh sáng mặt trời tiêu diệt virus sau 5 - 10 giờ. Các chất sát trùng đặc biệt là acid cĩ thể tiêu diệt virus nhanh chĩng như dung dịch HCl 3 - 5%, formol 5% diệt virus sau 5 - 10 phút, HgCl2 diệt virus sau vài phút. Trong điều kiện khơ và lạnh virus sống lâu, trong não ướp lạnh virus cĩ thể tồn tại trong 2 năm. Ở nhiệt độ phịng virus cĩ thể tồn tại 1 - 2 tuần vì vậy đồ dùng dính nước bọt của con bệnh hay người bệnh được coi như nguy hiểm.
Virus dại cĩ chứa 22% lipid, là một chất béo nên khi tiếp xúc với chất hịa tan mỡ như nước xà phịng, virus dễ bị phá hủy (Bùi Quý Huy, 2002). Virus dại cĩ thể sống 2 tháng trong dung dịch phenol 0,5% và 4oC. Virus dại cĩ thể sống sĩt trong vịng 24 giờ
ở 20oC và cĩ thể lâu hơn nếu bệnh phẩm được bảo quản lạnh. Bệnh phẩm chứa virus được bảo quản tốt trong dung dịch glycerin 50% để ở nhiệt độ phịng hoặc tốt hơn là 4oC trong glycerin nguyên chất, pH tốt nhất cĩ thể bảo quản virus sống lâu là 5,4 – 7. Khi bảo quản ở nhiệt độ thấp (từ -30oC đến -80oC) cĩ thể kéo dài sự sống của virus (Dương Đình Thiện, 2001).
2.1.8 Sự truyền lây và cơ chế gây bệnh của virus dại
Sự lây truyền xảy ra thường là do sự xâm nhập của nước bọt chứa virus dại vào mơ bào sau khi bị động vật mang virus dại cắn. Mặc dù trong một số trường hợp cĩ thể là do virus từ nước bọt, tuyến nước bọt hoặc từ não con vật mắc bệnh lây nhiễm qua vết thương trên da hoặc cĩ thể qua niêm mạc. Thơng thường, nước bọt cĩ tính truyền lây tại thời điểm xuất hiện các triệu chứng lâm sàng; nhưng chĩ nhà, mèo và chồn cĩ thể bài xuất virus vài ngày trước khi xuất hiện triệu chứng. Thời kỳ ủ bệnh kéo dài và biến động. Đặc trưng của virus nằm ở vị trí xâm nhập trong một thời gian tương đối dài. Độ dài ngày trong thời kỳ ủ bệnh cĩ thể do hoạt động hữu hiệu của globulin miễn dịch với virus dại tại chỗ sau phơi nhiễm ở người. Trong đa số các trường hợp, virus dại trên chĩ sẽ phát bệnh trong vịng 21- 80 ngày sau phơi nhiễm, nhưng thời gian ủ bệnh cĩ thể ngắn hoặc dài hơn. Một trường hợp bệnh dại ở người được báo cáo ở Mỹ cĩ thời gian ủ bệnh trên 6 năm (Begeman et al., 2018; Udow et al., 2013).
Virus lây truyền hướng thần kinh ngoại biên vào tủy sống và đi lên não (Hình 2.3). Sau khi vào não, virus di chuyển theo thần kinh ngoại biên xuống tuyến nước bọt. Nếu động vật cĩ khả năng truyền lây virus dại qua nước bọt, virus cĩ thể phát hiện thấy trong não. Virus được bài xuất trong nước bọt khơng liên tục (Udow et al., 2013; Hemachudha et al., 2013).
Hình 2.3: Quá trình sinh bệnh dại ở người (Shite et al., 2015)
Virus dại khơng truyền lây qua đường máu. Sự truyền lây qua khơng khí xảy ra khi khơng khí chứa nồng độ cao các hạt lơ lửng mang virus và nĩ khơng gây nguy hiểm. Sự truyền lây qua khơng khí xảy ra khi truyền lây bệnh thực nghiệm hoặc trong tự nhiên ở những hang động cĩ hàng triệu con dơi cư ngụ. Các chất tiết ở miệng và mũi chứa virus cĩ thể được hĩa bụi từ 10.000 con dơi mang virus dại. Nhiễm trùng qua khơng khí cĩ thể xảy ra qua con đường gắn virus vào các đầu mút thần kinh khứu giác (Udow et al., 2013; Piccinotti and Whelan, 2016;).
Quá trình lây nhiễm virus dại được chia thành ba giai đoạn. Giai đoạn đầu: virus gắn vào các thụ thể trên tế bào chủ nhạy cảm, bắt đầu sự xâm nhập trực tiếp bằng phản ứng dung hợp của virus với màng sinh chất của tế bào chủ và giải phĩng RNP dạng xoắn. Giai đoạn thứ hai: quá trình phiên mã bộ gen và tổng hợp protein của virus. Giai đoạn thứ ba: lắp ráp thành cấu trúc hồn chỉnh và đi ra khỏi tế bào bị nhiễm virus. (Albertini et al.,
2011; Piccinotti and Whelan, 2016).
2.1.8.1 Giai đoạn đầu: vai trị của thụ thể RABV, nội bào và hợp nhất qua trung gian G
Sự lây nhiễm RABV bắt đầu khi virus bám vào bề mặt của tế bào đích và xâm nhập vào tế bào thơng qua con đường vận chuyển nội bào (Hình 2.4). Rất cĩ thể, virus tự gắn vào đơn vị thụ thể (cellular receptor unit = CRU) trên bề mặt tế bào để xâm nhập
trực tiếp vào các tế bào nhạy cảm hoặc tế bào đích. Một trong những CRU này là thụ thể nicotinic acetylcholine (nAChR) được tìm thấy tại các điểm nối thần kinh cơ. Tuy nhiên, khơng phải tất cả các tế bào bị nhiễm RABV in vitro bao gồm tế bào thần kinh đều cĩ biểu hiện nAChR. Khả năng khác là phân tử kết dính tế bào thần kinh CD56 trên bề mặt các tế bào nhạy cảm với RABV và thụ thể tế bào thần kinh p75 ái lực thấp (p75NTR). Ngồi ra, cịn phụ thuộc vào sự phát triển hệ thống thần kinh. Một số nghiên cứu gần đây cho thấy mGluR2 cũng là đơn vị thụ thể tế bào. Điều này cho thấy virus khơng bị giới hạn bởi một loại thụ thể đặc hiệu nào để bắt đầu quá trình lây nhiễm bệnh cho động vật (Piccinotti and Whelan, 2016; Wang et al., 2018).
Sau khi virus liên kết với thụ thể trên tế bào chủ, RABV sẽ tiến hành nhập bào bằng cách xâm nhập vào các viropexis (sự cố định virus) hoặc ẩm bào. Một phần của quá trình nhập bào là sự hợp nhất giữa màng virus và màng nội bào được kích hoạt trong mơi trường acid (pH 6,3 - 6,5) kích thích phản ứng tổng hợp, một loạt các thay đổi cấu trúc cụ thể diễn ra trong RABV G, theo đĩ nĩ giả định ít nhất ba trạng thái “cấu trúc” riêng biệt về cấu trúc (Albertini et al., 2012; Piccinotti and Whelan, 2016).
Trước khi liên kết với thụ thể tế bào, trên bề mặt virion G ở trạng thái nguyên bản. Sau khi virus gắn vào thụ thể và được nhập bào, G được “kích hoạt” sang trạng thái kỵ nước, cho phép nĩ tương tác với màng nội chất kỵ nước. Khi đi vào nội bào cĩ mơi trường pH thấp sẽ kích hoạt khả năng dung hợp của G thơng qua sự thay đổi cấu trúc trong G làm bộc lộ vùng dung hợp và tương tác với màng tế bào đích (Sakai et al., 2004; Albertini et al., 2012). Sau đĩ một cấu trúc giả định G dung hợp bị bất hoạt làm cho G xuất hiện lâu hơn cấu trúc “bản địa” và giả định sự phân biệt kháng nguyên cĩ chọn lọc. G dung hợp bất hoạt rất nhạy cảm với các protease tế bào và dường như ở trạng thái cân bằng động với G “bản địa” được điều chỉnh bằng cách hạ thấp và tăng độ pH. Các MAbs nhận biết các biểu mơ cấu trúc nhạy cảm với pH thấp, cĩ thể xác định các thay đổi cấu trúc do acid gây ra, cũng như phát hiện các giai đoạn khác nhau của quá trình tạo ra G mới và sự liên kết của nĩ với các chaperones phân tử (Kankanamge et al., 2003).
Hình 2.4: Quá trình lây nhiễm của virus dại (Fooks and Jackson, 2020)
2.1.8.2 Giai đoạn thứ hai: Phiên mã, sao chép và tổng hợp protein
Giải phĩng RNP của virus bắt đầu bằng việc phiên mã, sao chép và tổng hợp protein của bộ gen RNA. Quá trình phiên mã hệ gen vRNA được bắt đầu trong tế bào chất của tế bào bị nhiễm. Với sự phân ly của M khỏi RNP, thì cấu trúc RNP sẽ giãn ra và tạo thành một chuỗi xoắn lỏng lẻo, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sao chép vRNA. RNP cĩ vai trị là khuơn mẫu để tổng hợp RNA, cĩ khoảng 50 RNA polymerase liên kết với RNP (L-P). Một số nghiên cứu cho thấy polymerase bắt đầu phiên mã ở đầu 3’ của RNA hoặc ở mRNA virus. Sự tái nhập polymerase được giải phĩng sau phiên mã gen L hoặc polymerase dẫn đến phiên mã gradient điển hình, trong đĩ mARN của gen gần 3' được phiên mã nhiều hơn (Lahaye et al., 2009; Nikolic et al., 2017).
Các protein virus được tổng hợp từ các mRNA của virus thơng qua sự tổng hợp protein của tế bào chủ. G-mRNA được dịch mã trên các polyribosome liên kết màng (polysomes) và được đưa vào ER, tại đây hình thành liên kết disulfua sau đĩ nĩ được vận chuyển ra khỏi ER. Bốn mRNA khác của virus (N-, P-, M- và L-mRNA) được dịch mã trên các polysome “tự do” trong tế bào chất. Khi M tích tụ trong tế bào chất của tế bào bị nhiễm cĩ khả năng tương tác đặc biệt với yếu tố khởi đầu quá trình dịch mã của các sinh vật nhân chuẩn, đồng thời kiểm sốt quá trình dịch mã trong các tế bào bị nhiễm để dịch mã mRNA của virus. Sự tích lũy của các protein virus khác, đặc biệt là N và P bắt đầu sao chép, bao gồm tổng hợp N-encapsidation của N-cRNA. Chúng đĩng vai trị
như các khuơn mẫu để khuếch đại N-vRNA của bộ gen, cĩ thể phục vụ trong quá trình phiên mã (thứ cấp) và biểu hiện protein (Lahaye et al., 2009; Nikolic et al., 2017).
Sự tích tụ của các protein dẫn đến sự hình thành các IB trong tế bào chất, chúng tăng kích thước theo thời gian. Các IB này được gọi là NB trong tế bào thần kinh, cĩ thể dễ dàng phát hiện bằng cách nhuộm và được dùng trong chẩn đốn nhiễm RABV. Các IB là nơi sản xuất virus với các đặc tính của bào quan lỏng. Các IB chứa tồn bộ bộ máy sao chép (bao gồm protein N, P và L, vRNA, cRNA và mRNA, cũng như protein M và một số tế bào protein bao gồm HSP70 và FAK, tương tác với protein N và P). Nucleocapsid của virus được đẩy ra khỏi IB và tạo thành virion mới hoặc nhà máy sản xuất virus thứ cấp. Các mRNA của virus luơn nhiều hơn so với các RNP của bộ gen, nghĩa là quá trình phiên mã của mRNA vẫn là phương thức tổng hợp RNA chính trong suốt quá trình lây nhiễm. Ban đầu các protein được tạo ra để sao chép vRNA, ở các giai đoạn sau, chúng cần với số lượng lớn để lắp ráp virus thế hệ sau. Khuơn mẫu N-vRNA cần cho cả hai quá trình này và được sản xuất ở mức cao hơn so với cRNA (Nikolic et al., 2017; Fouquet et al., 2015).
2.1.8.3 Giai đoạn thứ ba: Sự lắp ráp và xâm nhập của virus thế hệ sau
Quá trình lắp ráp virus (hình thái RABV) bắt đầu ở giai đoạn giữa của vịng đời. Bắt đầu quá trình này là sự hình thành vRNA-N-P, virus cần đủ lượng N, P và L để hỗ trợ sự hình thành RNP. Sự phát sinh hình thái của RABV cĩ liên quan đến sự hình thành các IB (NB) như các vị trí tập hợp virus ở các tế bào thần kinh trong mơ não, cũng như trong nuơi cấy mơ. Sự kết hợp của RNP thế hệ sau và các virion vẫn tiếp tục và các tế bào vẫn hoạt động về mặt trao đổi chất (Nikolic et al., 2017; Mavrakis et al., 2003).
M là protein virus tiếp theo liên kết với phức hợp RNP. M xâm nhập vào việc lắp ráp virus như một protein hịa tan trong tế bào chất, nĩ tham gia vào tất cả các bước dẫn đến sự xâm nhập của virus. M là một protein đa chức năng và nĩ đĩng vai trị quan trọng trong hình thành virus thế hệ sau. Đầu tiên, sự liên kết của M với RNP trong hoạt động phiên mã làm thay đổi sự cân bằng giữa phiên mã và sao chép RNA của virus bằng cách ức chế phiên mã và kích thích sao chép. Cuối cùng, M làm thay đổi cấu trúc của RNP bằng cách biến nĩ thành một dạng "giống như bộ khung". Trong chức năng này của M, virus bắt đầu xâm nhập màng tế bào nơi chúng được bao bọc bởi màng tế bào và xâm nhập vào quá trình xâm nhập của virus. Trong virion dại trưởng thành, M nằm giữa lớp vỏ kép lipid (được hình thành do tương tác với màng tế bào chủ) và RNP dạng xoắn. Do đĩ, M và RNP đĩng