5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN TRONG CÂY LÁ ĐẮNG
Tổng hợp các nghiên cứu thực nghiệm đã đƣợc công bố về thành phần hóa học của cây Lá đắng [39] [43] [44] [45] [46] [47] [48], 23 hợp chất có thành phần tƣơng đối lớn đƣợc tìm thấy trong các bộ phân khác nhau của cây Lá đắng. Tên, công thức phân tử và công thức cấu tạo của 20 hợp chất này đƣợc tổng hợp ở Bảng 2.2. Chúng đƣợc tách thành ba nhóm hợp chất, gồm flavonoid, terpenoid và các hợp chất khác, nhƣ đƣợc trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.2. Danh sách 20 hợp chất thiên nhiên đƣợc tìm thấy trong cây Lá đắng cùng với công thức phân tử (CTPT) và công thức cấu tạo (CTCT) của
chúng
STT Hợp chất CTPT CTCT
1 Luteolin C15H20O6
2 Luteolin7-O-
3 Luteolin-7-O-β - glucuronide C21H20O11 4 Isorhamnetin C16H12O7 5 11,13- Dihydrovernodalin C19H22O7 6 11β,13- Dihydrovernolide C19H24O7 7 Vernolide C19H22O7
8 Vernolepin C15H16O5 9 Vernodalin C19H20O7 10 Vernodalol C19H22O8 11 Hydroxyvernolide C20H24O8 12 Vernomygdin C19H24O7 13 Vernomenin C15H16O5
14 Phytol C20H40O 15 Neoandrographolide C26H42O8 16 Hexadecanoic C16H32O2 17 3,5-bis 1,1-dim ethylethyl phenol C14H22O 18 Tetradecanoic acid C14H28O2 19 9, 12- octadecadienoic acid C18H32O2 20 Cholestane C27H48
Dựa vào đặc điểm cấu trúc, 20 hợp chất trong cây Lá đắng đƣợc phân loại thành 3 nhóm chất: flavonoid, terpenoid và các hợp chất khác; đƣợc thể hiện trong Bảng 2.3.
Bảng 2.3. Phân loại các hợp chất thiên nhiên đƣợc tìm thấy trong cây Lá đắng
Nhóm chất Phân loại STT Kí
hiệu Tên thông thƣờng
Flavonoid 1 F-1 Luteolin 2 F-2 Luteolin7-O-glucoside 3 F-3 Luteolin-7-O-β - glucuronide 4 F-4 Isorhamnetin Terpennoid Sesquiterpenoid 5 T-1 11,13- Dihydrovernodalin 6 T-2 11β,13-Dihydrovernolide 11 T-3 Hydroxyvernolide 9 T-4 Vernodalin 10 T-5 Vernodalol 8 T-6 Vernolepin 7 T-7 Vernolide 13 T-8 Vernomenin 12 T-9 Vernomygdin Diterpenoid 15 T-10 Neoandrographolide 14 T-11 Phytol Các hợp chất 17 C-1 3, 5-bis 1,1
khác Dimethylethyl 19 C-2 9, 12-Octadecadienoic acid 20 C-3 Cholestane 16 C-4 Hexadecanoic 18 C-5 Tetradecanoic acid 2.3. Thụ thể EGFR và HER2
EGFR và HER2 là hai thành viên của họ thụ thể Erythroblastic B (ErbB) bao gồm 4 thành viên: ErbB-1 (còn gọi là EGFR hoặc HER1), ErbB-2 (HER2/neu), ErbB-3 (HER3) và ErbB-4 (HER4). Cấu trúc của các ErbB tƣơng tự nhau, bao gồm 3 phần [49].
i. Thùy N chủ yếu là các chuỗi β-strand và một chuỗi α-helix. ii. Thùy C gồm các chuỗi α-helix.
iii. Vùng bản lề (hinge region) hay còn gọi là khe liên kết ATP là vùng nối thùy N và thùy C với nhau.
Trong đó, thùy N là nơi tiếp nhận các tín hiệu từ ligand để truyền vào
thùy C nằm bên trong tế bào chất, có vai trò hoạt hóa tyrosine để kích hoạt kinase. Thụ thể tyrosine kinase sẽ đƣợc kích hoạt nếu ATP đƣợc gắn vào vùng bản lề [50]. Việc mất kiểm soát quá trình này, làm cho biểu hiện của EGFR và HER2 biểu hiện quá mức, gây nên những khối u ác tính trong các loại ung thƣ nhƣ ung thƣ vú, ung thƣ tử cung, ung thƣ dạ dày. Do đó, việc ức chế và cản trở quá trình liên kết ATP với vùng bản lề là chìa khóa mấu chốt để nhắm tới các thụ thể tyrosine kinase khi điều trị ung thƣ do các thụ thể này gây ra [51].
và HER2
Một số loại thuốc tổng hợp đƣợc sử dụng làm chất đối chiếu trong nghiên cứu này đƣợc trình bày ở Bảng 2.4. Đây là các thuốc tổng hợp đã đƣợc FDA công nhận, cho phép sử dụng trong điều trị các bệnh ung thƣ liên quan đến sự hoạt động quá mức của các thụ thể họ ErbB [52].
Bảng 2.4. Một số loại thuốc tổng hợp đang đƣợc sử dụng trong điều trị các bệnh ung thƣ có liên quan đến các thụ thể EGFR và HER2
Hợp chất (Tên thƣơng
mại)
Công thức phân tử
Loại ung thƣ điều
trị KLPT (amu) Erlotinib (Tarceva) C22H23N3O4 Ung thƣ phổi không tế bào nhỏ, ung thƣ tuyến tụy
393,4
Lapatinib (Tykerb)
C29H26ClFN4O4S Ung thƣ vú 581,1
Erlotinib (tên thƣơng mại là Tarceva), Lapatinib (tên thƣơng mại là Tykreb) là các phân tử nhỏ đầu tiên đƣợc phê duyệt sử dụng trong điều trị bệnh ung thƣ vú và các u rắn khác. Erlotinib và Lapatinib đều đƣợc xây dựng dựa trên cấu trúc 4-quinazoline [50] và gồm có 3 phần chính nhƣ đƣợc mô tả trong Hình 2.2.
Hình 2.2. Cấu trúc 3 phần cơ bản của thuốc ức chế thiết kế dựa trên khung 4-quinazoline [50].
- Phần đầu kị nƣớc sẽ đi vào túi kị nƣớc đƣợc tạo nên từ thùy N và C của thụ thể, những liên kết kị nƣớc sẽ đƣợc hình thành ở vùng này. Đặc biệt, trên túi kị nƣớc nằm ở thùy N các mạch nhánh có vai trò gác cổng (gatekeeper) tăng tính chọn lọc cho thuốc.
- Phần khung cứng 4-quinazoline liên kết với vùng bản lề bằng liên kết hydrogen.
- Phần đuôi chứa các nhóm chất ƣa nƣớc liên kết với vùng hòa tan thuộc thùy C nằm trong tế bào chất, nhiều liên kết hydrogen đƣợc hình thành ở vùng này, có ý nghĩa dƣợc động học của thuốc.
Mỗi loại thụ thể có hai cấu dạng: hoạt động (active) và không hoạt động (inactive). Hình 2.3 minh họa sự khác nhau giữa hai cấu dạng của một thụ thể. Tùy thuộc vào cấu dạng thụ thể mà thiết kế thuốc ức chế phù hợp, vì thế thuốc nhắm đích đƣợc chia làm hai loại: thuốc ức chế loại I (là thuốc ức chế cấu dạng hoạt động của thụ thể) và thuốc ức chế loại II (là thuốc ức chế cấu dạng không hoạt động của thụ thể). Hình 2.4 minh họa cấu trúc của các cấu dạng có thể có của hai thụ thể EGFR và HER2 đƣợc nghiên cứu
trong luận văn này. Thụ thể EGFR có cả 2 cấu dạng đó [53]. Erlotinib ức chế dạng hoạt động của EGFR (mã PDB: 1M17) nên là thuốc ức chế loại I, còn Lapatinib ức chế dạng không hoạt động của EGFR (mã PDB: 1XKK) nên là chất ức chế loại II. Còn với HER2, Erlotinib và Lapatinib là chất ức chế loại I do ức chế đƣợc với dạng hoạt động của thụ thể (mã PDB: 3PP0). Do đó, khi nghiên cứu về docking phân tử những loại thuốc trên với thụ thể cần lựa chọn đúng mã PDB của protein đích để cho kết quả chính xác [54]
Hình 2.3. Cấu dạng hoạt động (active) và không hoạt động (inactive) của thụ thể [54]
Trên ngân hàng dữ liệu protein (PDB), có nhiều mã protein của hai thụ thể EGFR-TK và HER2-TK đã đƣợc nghiên cứu và công bố. Đối với mỗi mã, cần biết đƣợc cấu dạng nào của thụ thể đang đƣợc mô tả, để lựa chọn thụ thể đích phù hợp trong quá trình docking phân tử. Cấu trúc 3D của các cấu dạng thuộc 2 thụ thể chúng tôi chọn trong nghiên cứu này đƣợc thể hiện trong Hình 2.4
a) Cấu dạng hoạt động của EGFR- TK (mã PDB: 1M17)
b) Cấu dạng không hoạt động của EGFR-TK (mã PDB: 1XKK)
c) Cấu dạng hoạt động của HER2-TK (mã PDB: 3PP0)
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Docking phân tử các phân tử thuốc vào EGFR-TK
3.1.1. Tối ưu hóa các phân tử thuốc
Cấu trúc phân tử của Erlotinib, Lapatinib đƣợc tải về từ ngân hàng cơ sở dữ liệu cấu trúc phân tử Pubchem, sau đó đƣợc tối ƣu hóa hình học bằng phƣơng pháp bán kinh nghiệm PM6 sử dụng phần mềm tính toán hóa học lƣợng tử Gaussian 09.
3.1.2. Docking phân tử các phân tử thuốc tổng hợp
Khảo sát tƣơng tác giữa EGFR-TK với các phân tử Erlotinib, Lapatinib. Không gian khảo sát docking phân tử (gridmap) có các thông số nhƣ sau: khoảng cách không gian lƣới điểm là 0,375 Å, kích thƣớc của lƣới điểm là 100 x 100 x 100, toạ độ tâm của lƣới điểm (x ; y ; z) = (12,484; 21,715; 34,076). Phân tử thuốc Lapatinib đƣợc docking phân tử với thụ thể EGFR cấu dạng không hoạt động (mã PDB: 1XKK). Trong khi phân tử thuốc Erlotinib sẽ đƣợc docking với cấu dạng hoạt động của thụ thể EGFR (mã: 1M17). Tiến hành tìm kiếm ngẫu nhiên 50 phức có năng lƣợng liên kết thấp nhất giữa phối tử và protein bằng phƣơng pháp Lamarckian GA, chọn ra phức có năng lƣợng liên kết âm gần với thuốc so sánh để phân tích. Những phối tử có năng lƣợng liên kết khác xa so với thuốc so sánh sẽ đƣợc chạy lại với số lần tìm kiếm ngẫu nhiên là 100 rồi chọn ra phức có năng lƣợng liên kết âm nhất để phân tích. Kết quả thu đƣợc trong Bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả docking phân tử các phân tử thuốc tổng hợp với thụ thể EGFR-TK Phân tử Mã PDB của thụ thể Năng lƣợng liên kết (kcal/mol) Năng lƣợng tƣơng tác (kcal/mol) Năng lƣợng quay tự do (kcal/mol) Erlotinib 1M17 -7,76 -10,74 2,98 Lapatinib 1XKK -12,59 -15.87 3,28
3.1.3. Tương tác với các phân tử thuốc tổng hợp
Tiến hành phân tích chi tiết liên kết trong phức có năng lƣợng liên kết thấp nhất trong 50 phức giữa phân tử thuốc tổng hợp với EGFR-TK.
Tương tác của Lapatinib với thụ thể EGFR-TK
Hình 3.1. Tƣơng tác của Lapatinib với thụ thể EGFR-TK (mã PDB: 1XKK)
Hình 3.1 cho thấy vòng quinazoline của Lapatinib tạo liên kết hydrogen dạng N-HN có độ dài 2,29 Å với Met793, một amino acid ở khu vực bản lề, nơi gắn kết ATP. Lapatinib còn tạo các tƣơng tác kị nƣớc với các amino acid: Leu718, Val726, Ala743, Lys745, Met766, Leu788 và Leu844 cho thấy Lapatinib có phần đuôi kéo dài vào túi kị nƣớc, nơi chứa ATP. Bên cạnh đó, việc hình thành liên kết hydrogen với Cys797, một amino acid nằm ở thùy C của kinase. Liên kết này cho thấy Lapatinib đã tƣơng tác với vùng nội bào của tế bào, thực hiện nhiệm vụ dƣợc động lực học của thuốc. Nhƣ vậy, Lapatinib có cấu tạo cơ bản của một chất ức chế dựa trên khung 4-quinazoline.
Tương tác của Erlotinib với thụ thể EGFR-TK
Hình 3.2. Tƣơng tác của Erlotinib với thụ thể EGFR-TK (mã PDB: 1M17) Tƣơng tự nhƣ Lapatinib, Erlotinib cũng thể hiện 3 phần của một chất ức chế thông thƣờng, gồm: vòng 4-quinazoline hình thành liên kết hydrogen dạng N-HN có độ dài liên kết 1,95Å với amino acid bản lề là Met769; nhóm cồng kềnh kéo dài vào túi kị nƣớc chứa ATP, hình thành tƣơng tác với các amino acid nhƣ: Ala719, Lys721, Met742, Leu764 và
nhóm ƣa nƣớc hình thành liên kết hydrogen với Cys773, là amino acid nằm trong vùng dung môi nội bào. Erlotinib cũng là chất ức chế tyrosine kinase theo cơ chế cạnh tranh với ATP. Tuy nhiên, do không hình thành đƣợc nhiều tƣơng tác và cấu trúc ít cồng kềnh hơn, nên năng lƣợng liên kết của Erlotinib (-7,76 kcal/mol) nhỏ hơn nhiều so với Lapatinib (-12,59 kcal/mol)
3.2. Docking phân tử các hợp chất tự nhiên trong cây Lá đắng vào thụ thể EGFR-TK thể EGFR-TK
Cấu trúc phân tử của các hợp chất tự nhiên trong cây Lá đắng đƣợc tải về từ ngân hàng cơ sở dữ liệu phân tử Pubchem sau đó đƣợc tối ƣu hóa hình học bằng phần mềm lƣợng tử Gaussian09 bằng phƣơng pháp bán kinh nghiệm PM6. Thực hiện docking phân tử EGFR-TK với 20 hợp chất đã đƣợc tối ƣu hóa ở mức lí thuyết PM6.
3.2.1. Các hợp chất flavonoid
Bảng 3.2. Các hợp chất flavonoid trong cây Lá đắng
STT Tên gọi Kí hiệu
KLPT (amu) 1 Luteolin F-1 286,2 2 Luteolin7-O-glucoside F-2 448,4 3 Luteolin-7-O-β -glucuronide F-3 462,4 4 Isorhamnetin F-4 316,3
Khảo sát tƣơng tác các hợp chất flavonoid trong cây Lá đắng với miền tyrosine kinase của thụ thể EGFR bằng phƣơng pháp docking phân tử, kết quả về các năng lƣợng liên kết và năng lƣợng tƣơng tác đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả docking phân tử của các hợp chất flavonoid với EGFR-TK (mã PDB: 1M17)
Bảng 3.3 cho ta thấy, năng lƣợng liên kết của 4 hợp chất flavonoid với EGFR-TK. Trong đó, cả bốn hợp chất đều có năng lƣợng liên kết âm hơn so với năng lƣợng liên kết trong phức EGFR-TK/Erlotinib. Để hiểu rõ hơn tƣơng tác và khả năng ức chế của bốn flavonoid này với EGFR-TK, tiến hành phân tích liên kết trong 4 phức EGFR-TK/F-1, EGFR-TK/F-2, EGFR- TK/F-3 và EGFR-TK/F-4.
a) Tƣơng tác EGFR-TK/F-1 b) Tƣơng tác EGFR-TK/F-2
Hợp chất Năng lƣợng liên kết (kcal/mol) Năng lƣợng tƣơng tác (kcal/mol) Năng lƣợng quay tự do (kcal/mol) F-1 -7,81 -9,30 1,49 F-2 -8,94 -12,22 3,28 F-3 -8,20 -11,48 3,28 F-4 -7,78 -9,57 1,79 Erlotinib -7,76 -10,74 2,98
c) Tƣơng tác EGFR-TK/F-3 d) Tƣơng tác EGFR-TK/F-4
Hình 3.3. Tƣơng tác của 4 hợp chất flavonoid với thụ thể EGFR-TK Trong bốn hợp chất flavonoid thì phức EGFR-TK/F-2 có năng lƣợng liên kết âm nhất, mặc dù có năng lƣợng quay tự do lớn (3,28 kcal/mol). Nguyên nhân là do F-2 tạo đƣợc nhiều tƣơng tác với EGFR . F-2 tạoliên kết hydrogen với amino acid bản lề Gly772 với độ dài liên kết 2,95 Å, yếu hơn so với liên kết hydrogen với vùng bản lề của Erlotinib. Nhƣng F-2 lại tạo đƣợc liên kết hydrogen OH với amino acid Asp831 nằm ở dải DFG. Việc tạo tƣơng tác với những amino acid ở dải này có nhiều ý nghĩa sinh học, vì DFG có tính bảo tồn cao trong tất cả các thụ thể tyrosine kinase và tham gia vào quá trình điều hòa các kinase [55]. Bên cạnh đó, F-2 còn hình thành tƣơng tác với Thr766, là một amino acid ở vùng gatekeeper, cho thấy khả năng chọn lọc cao trong ức chế EGFR tyrosine kinase. Đồng thời, F-2 còn tạo các tƣơng tác kị nƣớc với các amino acid nằm trong túi kị nƣớc I là
Val702, Ala719, Leu694 và túi kị nƣớc II là Leu820. Do đó, có thể đánh giá F-2 là chất có khả năng ức chế EGFR-TK tốt.
Hình 3.3c cho thấy tƣơng tác trong EGFR-TK/F-3 tƣơng tự nhƣ EGFR-TK/F-2. F-3 cũng hình thành tƣơng tác kị nƣớc với các amino acid trong túi kị nƣớc I và II nhƣ: Val702, Ala719, Lys721, Leu820. F-3 cũng hình thành liên kết hydrogen với amino acid bản lề là Met769 và amino acid dải DFG là Asp831. Tuy nhiên, vì độ dài liên kết OH với Asp831 (2,91 Å) lớn hơn so với độ dài liên kết OH trong F-2 (2,75 Å) nên năng lƣợng liên kết của F-3 ít âm hơn so với F-2. Nhƣng F-3 vẫn đƣợc đánh giá là có hoạt tính sinh học tốt với EGFR-TK.
Phân tích các tƣơng tác giữa F-1 và F-4 với EGFR-TK cho thấy hai chất này đều hình thành tƣơng tác kị nƣớc với các amino acid trong túi kị nƣớc chứa ATP nhƣ Ala719, Lys721, Leu694, Leu820. Cả hai hợp chất đều hình thành liên kết hydrogen với hai amino acid quan trọng là Met769 và Asp831. Nhƣng vì cấu trúc của F-1 và F-4 nhỏ gọn hơn nhiều so với F-2 và F-3, nên trong quá trình xảy ra tƣơng tác với phức, biến thiên entropy không tăng cao nhƣ trong phức EGFR-TK/F-2 và EGFR-TK/F-3, do đó năng lƣợng tƣơng tác nhỏ. Do năng lƣợng quay tự do của trong EGFR- TK/F-1 (1,49 kcal/mol) và EGFR-TK/F-4 (1,79 kcal/mol) nhỏ nên năng lƣợng liên kết của hai phức này vẫn khá âm. Cho nên, cần nghiên cứu phát triển thêm F-1 và F-4 để trở thành chất ức chế tiềm năng với sự biểu hiện quá mức do EGFR-TK gây nên.
3.2.2. Các hợp chất terpenoid
Các hợp chất terpenoid có trong cây Lá đắng đƣợc chia thành hai loại, gồm sesquiterpenoid và diterpenoid. Bảng 3.4 chỉ ra phân loại, kí hiệu, tên gọi và khối lƣợng phân tử của các hợp chất terpennoid đƣợc phân lập từ cây Lá đắng.
Bảng 3.4. Các hợp chất terpenoid trong cây Lá đắng
Loại hợp chất Tên gọi Kí hiệu KLPT (amu) Sesquiterpenoid 11,13- Dihydrovernodalin T-1 364,4 11β,13-Dihydrovernolide T-2 364,4 Hydroxyvernolide T-3 378,4 Vernodalin T-4 360,4 Vernodalol T-5 392,4 Vernolepin T-6 276,3 Vernolide T-7 362,4 Vernomenin T-8 276,3 Vernomygdin T-9 364,4 Diterpenoid Neoandrographolide T-10 480,6 Phytol T-11 296,5
Bảng 3.5 là kết quả mô phỏng docking phân tử các hợp chất terpenoid vào thụ thể EGFR-TK.
Bảng 3.5. Kết quả docking phân tử các hợp chất terpenoid với EGFR-TK (mã PDB: 1M17) Hợp chất Năng lƣợng liên kết (kcal/mol) Năng lƣợng tƣơng tác (kcal/mol) Năng lƣợng quay tự do (kcal/mol) T-1 -8,46 -10,25 1,79 T-2 -7,36 -8,55 1,19
T-3 -7,76 -9,75 1,79 T-4 -8,84 -10,63 1,79 T-5 -7,68 -10,66 2,98