5. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1.2. Docking phân tử các phân tử thuốc tổng hợp
Khảo sát tƣơng tác giữa EGFR-TK với các phân tử Erlotinib, Lapatinib. Không gian khảo sát docking phân tử (gridmap) có các thông số nhƣ sau: khoảng cách không gian lƣới điểm là 0,375 Å, kích thƣớc của lƣới điểm là 100 x 100 x 100, toạ độ tâm của lƣới điểm (x ; y ; z) = (12,484; 21,715; 34,076). Phân tử thuốc Lapatinib đƣợc docking phân tử với thụ thể EGFR cấu dạng không hoạt động (mã PDB: 1XKK). Trong khi phân tử thuốc Erlotinib sẽ đƣợc docking với cấu dạng hoạt động của thụ thể EGFR (mã: 1M17). Tiến hành tìm kiếm ngẫu nhiên 50 phức có năng lƣợng liên kết thấp nhất giữa phối tử và protein bằng phƣơng pháp Lamarckian GA, chọn ra phức có năng lƣợng liên kết âm gần với thuốc so sánh để phân tích. Những phối tử có năng lƣợng liên kết khác xa so với thuốc so sánh sẽ đƣợc chạy lại với số lần tìm kiếm ngẫu nhiên là 100 rồi chọn ra phức có năng lƣợng liên kết âm nhất để phân tích. Kết quả thu đƣợc trong Bảng 3.1
Bảng 3.1. Kết quả docking phân tử các phân tử thuốc tổng hợp với thụ thể EGFR-TK Phân tử Mã PDB của thụ thể Năng lƣợng liên kết (kcal/mol) Năng lƣợng tƣơng tác (kcal/mol) Năng lƣợng quay tự do (kcal/mol) Erlotinib 1M17 -7,76 -10,74 2,98 Lapatinib 1XKK -12,59 -15.87 3,28
3.1.3. Tương tác với các phân tử thuốc tổng hợp
Tiến hành phân tích chi tiết liên kết trong phức có năng lƣợng liên kết thấp nhất trong 50 phức giữa phân tử thuốc tổng hợp với EGFR-TK.
Tương tác của Lapatinib với thụ thể EGFR-TK
Hình 3.1. Tƣơng tác của Lapatinib với thụ thể EGFR-TK (mã PDB: 1XKK)
Hình 3.1 cho thấy vòng quinazoline của Lapatinib tạo liên kết hydrogen dạng N-HN có độ dài 2,29 Å với Met793, một amino acid ở khu vực bản lề, nơi gắn kết ATP. Lapatinib còn tạo các tƣơng tác kị nƣớc với các amino acid: Leu718, Val726, Ala743, Lys745, Met766, Leu788 và Leu844 cho thấy Lapatinib có phần đuôi kéo dài vào túi kị nƣớc, nơi chứa ATP. Bên cạnh đó, việc hình thành liên kết hydrogen với Cys797, một amino acid nằm ở thùy C của kinase. Liên kết này cho thấy Lapatinib đã tƣơng tác với vùng nội bào của tế bào, thực hiện nhiệm vụ dƣợc động lực học của thuốc. Nhƣ vậy, Lapatinib có cấu tạo cơ bản của một chất ức chế dựa trên khung 4-quinazoline.
Tương tác của Erlotinib với thụ thể EGFR-TK
Hình 3.2. Tƣơng tác của Erlotinib với thụ thể EGFR-TK (mã PDB: 1M17) Tƣơng tự nhƣ Lapatinib, Erlotinib cũng thể hiện 3 phần của một chất ức chế thông thƣờng, gồm: vòng 4-quinazoline hình thành liên kết hydrogen dạng N-HN có độ dài liên kết 1,95Å với amino acid bản lề là Met769; nhóm cồng kềnh kéo dài vào túi kị nƣớc chứa ATP, hình thành tƣơng tác với các amino acid nhƣ: Ala719, Lys721, Met742, Leu764 và
nhóm ƣa nƣớc hình thành liên kết hydrogen với Cys773, là amino acid nằm trong vùng dung môi nội bào. Erlotinib cũng là chất ức chế tyrosine kinase theo cơ chế cạnh tranh với ATP. Tuy nhiên, do không hình thành đƣợc nhiều tƣơng tác và cấu trúc ít cồng kềnh hơn, nên năng lƣợng liên kết của Erlotinib (-7,76 kcal/mol) nhỏ hơn nhiều so với Lapatinib (-12,59 kcal/mol)
3.2. Docking phân tử các hợp chất tự nhiên trong cây Lá đắng vào thụ thể EGFR-TK thể EGFR-TK
Cấu trúc phân tử của các hợp chất tự nhiên trong cây Lá đắng đƣợc tải về từ ngân hàng cơ sở dữ liệu phân tử Pubchem sau đó đƣợc tối ƣu hóa hình học bằng phần mềm lƣợng tử Gaussian09 bằng phƣơng pháp bán kinh nghiệm PM6. Thực hiện docking phân tử EGFR-TK với 20 hợp chất đã đƣợc tối ƣu hóa ở mức lí thuyết PM6.
3.2.1. Các hợp chất flavonoid
Bảng 3.2. Các hợp chất flavonoid trong cây Lá đắng
STT Tên gọi Kí hiệu
KLPT (amu) 1 Luteolin F-1 286,2 2 Luteolin7-O-glucoside F-2 448,4 3 Luteolin-7-O-β -glucuronide F-3 462,4 4 Isorhamnetin F-4 316,3
Khảo sát tƣơng tác các hợp chất flavonoid trong cây Lá đắng với miền tyrosine kinase của thụ thể EGFR bằng phƣơng pháp docking phân tử, kết quả về các năng lƣợng liên kết và năng lƣợng tƣơng tác đƣợc trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả docking phân tử của các hợp chất flavonoid với EGFR-TK (mã PDB: 1M17)
Bảng 3.3 cho ta thấy, năng lƣợng liên kết của 4 hợp chất flavonoid với EGFR-TK. Trong đó, cả bốn hợp chất đều có năng lƣợng liên kết âm hơn so với năng lƣợng liên kết trong phức EGFR-TK/Erlotinib. Để hiểu rõ hơn tƣơng tác và khả năng ức chế của bốn flavonoid này với EGFR-TK, tiến hành phân tích liên kết trong 4 phức EGFR-TK/F-1, EGFR-TK/F-2, EGFR- TK/F-3 và EGFR-TK/F-4.
a) Tƣơng tác EGFR-TK/F-1 b) Tƣơng tác EGFR-TK/F-2
Hợp chất Năng lƣợng liên kết (kcal/mol) Năng lƣợng tƣơng tác (kcal/mol) Năng lƣợng quay tự do (kcal/mol) F-1 -7,81 -9,30 1,49 F-2 -8,94 -12,22 3,28 F-3 -8,20 -11,48 3,28 F-4 -7,78 -9,57 1,79 Erlotinib -7,76 -10,74 2,98
c) Tƣơng tác EGFR-TK/F-3 d) Tƣơng tác EGFR-TK/F-4
Hình 3.3. Tƣơng tác của 4 hợp chất flavonoid với thụ thể EGFR-TK Trong bốn hợp chất flavonoid thì phức EGFR-TK/F-2 có năng lƣợng liên kết âm nhất, mặc dù có năng lƣợng quay tự do lớn (3,28 kcal/mol). Nguyên nhân là do F-2 tạo đƣợc nhiều tƣơng tác với EGFR . F-2 tạoliên kết hydrogen với amino acid bản lề Gly772 với độ dài liên kết 2,95 Å, yếu hơn so với liên kết hydrogen với vùng bản lề của Erlotinib. Nhƣng F-2 lại tạo đƣợc liên kết hydrogen OH với amino acid Asp831 nằm ở dải DFG. Việc tạo tƣơng tác với những amino acid ở dải này có nhiều ý nghĩa sinh học, vì DFG có tính bảo tồn cao trong tất cả các thụ thể tyrosine kinase và tham gia vào quá trình điều hòa các kinase [55]. Bên cạnh đó, F-2 còn hình thành tƣơng tác với Thr766, là một amino acid ở vùng gatekeeper, cho thấy khả năng chọn lọc cao trong ức chế EGFR tyrosine kinase. Đồng thời, F-2 còn tạo các tƣơng tác kị nƣớc với các amino acid nằm trong túi kị nƣớc I là
Val702, Ala719, Leu694 và túi kị nƣớc II là Leu820. Do đó, có thể đánh giá F-2 là chất có khả năng ức chế EGFR-TK tốt.
Hình 3.3c cho thấy tƣơng tác trong EGFR-TK/F-3 tƣơng tự nhƣ EGFR-TK/F-2. F-3 cũng hình thành tƣơng tác kị nƣớc với các amino acid trong túi kị nƣớc I và II nhƣ: Val702, Ala719, Lys721, Leu820. F-3 cũng hình thành liên kết hydrogen với amino acid bản lề là Met769 và amino acid dải DFG là Asp831. Tuy nhiên, vì độ dài liên kết OH với Asp831 (2,91 Å) lớn hơn so với độ dài liên kết OH trong F-2 (2,75 Å) nên năng lƣợng liên kết của F-3 ít âm hơn so với F-2. Nhƣng F-3 vẫn đƣợc đánh giá là có hoạt tính sinh học tốt với EGFR-TK.
Phân tích các tƣơng tác giữa F-1 và F-4 với EGFR-TK cho thấy hai chất này đều hình thành tƣơng tác kị nƣớc với các amino acid trong túi kị nƣớc chứa ATP nhƣ Ala719, Lys721, Leu694, Leu820. Cả hai hợp chất đều hình thành liên kết hydrogen với hai amino acid quan trọng là Met769 và Asp831. Nhƣng vì cấu trúc của F-1 và F-4 nhỏ gọn hơn nhiều so với F-2 và F-3, nên trong quá trình xảy ra tƣơng tác với phức, biến thiên entropy không tăng cao nhƣ trong phức EGFR-TK/F-2 và EGFR-TK/F-3, do đó năng lƣợng tƣơng tác nhỏ. Do năng lƣợng quay tự do của trong EGFR- TK/F-1 (1,49 kcal/mol) và EGFR-TK/F-4 (1,79 kcal/mol) nhỏ nên năng lƣợng liên kết của hai phức này vẫn khá âm. Cho nên, cần nghiên cứu phát triển thêm F-1 và F-4 để trở thành chất ức chế tiềm năng với sự biểu hiện quá mức do EGFR-TK gây nên.
3.2.2. Các hợp chất terpenoid
Các hợp chất terpenoid có trong cây Lá đắng đƣợc chia thành hai loại, gồm sesquiterpenoid và diterpenoid. Bảng 3.4 chỉ ra phân loại, kí hiệu, tên gọi và khối lƣợng phân tử của các hợp chất terpennoid đƣợc phân lập từ cây Lá đắng.
Bảng 3.4. Các hợp chất terpenoid trong cây Lá đắng
Loại hợp chất Tên gọi Kí hiệu KLPT (amu) Sesquiterpenoid 11,13- Dihydrovernodalin T-1 364,4 11β,13-Dihydrovernolide T-2 364,4 Hydroxyvernolide T-3 378,4 Vernodalin T-4 360,4 Vernodalol T-5 392,4 Vernolepin T-6 276,3 Vernolide T-7 362,4 Vernomenin T-8 276,3 Vernomygdin T-9 364,4 Diterpenoid Neoandrographolide T-10 480,6 Phytol T-11 296,5
Bảng 3.5 là kết quả mô phỏng docking phân tử các hợp chất terpenoid vào thụ thể EGFR-TK.
Bảng 3.5. Kết quả docking phân tử các hợp chất terpenoid với EGFR-TK (mã PDB: 1M17) Hợp chất Năng lƣợng liên kết (kcal/mol) Năng lƣợng tƣơng tác (kcal/mol) Năng lƣợng quay tự do (kcal/mol) T-1 -8,46 -10,25 1,79 T-2 -7,36 -8,55 1,19
T-3 -7,76 -9,75 1,79 T-4 -8,84 -10,63 1,79 T-5 -7,68 -10,66 2,98 T-6 -7,91 -8,50 0,60 T-7 -7,39 -8,58 1,19 T-8 -7,92 -8,52 0,60 T-9 -7,54 -8,74 1,19 T-10 -8,31 -11,59 3,28 T-11 -6,60 -10,78 4,18 Erlotinib -7,76 -10,74 2,98
Bảng 3.5 cho thấy các hợp chất terpenoid đƣợc chia làm hai nhóm. Nhóm thứ nhất có năng lƣợng liên kết âm hơn so với thuốc Erlotinib gồm T-1, T-3, T-4, T-6, T-8 và T-10. Nhóm thứ hai có năng lƣợng liên kết dƣơng hơn so với thuốc gồm những terpenoid còn lại.
Phân tích chi tiết liên kết trong các phức của nhóm có năng lƣợng liên kết âm hơn so với thuốc Erlotinib, chúng tôi thu đƣợc mô phỏng tƣơng tác trong Hình 3.4.
c) Tƣơng tác EGFR-TK/T-4 d) Tƣơng tác EGFR-TK/T-6
e) Tƣơng tác EGFR-TK/T-8 f) Tƣơng tác EGFR-TK/T-10
Hình 3.4. Tƣơng tác của những hợp chất terpenoid có năng lƣợng liên kết âm hơn so với thuốc Erlotinib
Dữ liệu từ Bảng 3.5 cho thấy T-4 có năng lƣợng liên kết với EGFR- TK âm nhất. Về liên kết, T-4 có hình thành liên kết hydrogen với amino acid ở vùng bản lề Met769 và amino acid ở dải DFG là Asp831 với độ dài liên kết lần lƣợt là 1,81 Å và 2,92 Å. Ngoài ra, T-4 còn hình thành liên kết
kị nƣớc với Val702. Bên cạnh đó, T-4 còn hình thành liên kết hydrogen với Cys773, là amino acido thuộc thùy C. Nhƣ vậy, T-4 có đủ 3 phần cơ bản của một chất ức chế cạnh tranh ATP tƣơng tự nhƣ Erlotinib. Tuy nhiên, T-4 có năng lƣợng quay tự do nhỏ, cho thấy bộ khung của T-4 cứng nhắc, nên khó trở thành chất ức chế tiềm năng.
Tƣơng tự nhƣ T-4, T-1 cũng có bộ khung lõi hình thành liên kết hydrogen với 2 amino acid quan trọng, hình thành tƣơng tác với 2 amino acid trong túi kị nƣớc là Leu694, Val702 và liên kết hydrogen với amino acid Cys773 thuộc thùy C. Dó đó, T-1 cũng cần nghiên cứu và phát triển thêm để trở thành chất ức chế tiềm năng.
Khác với hai hợp chất trên, T-10 chỉ hình thành hai liên kết hydrogen bền với Asp831 nằm ở dải DFG với độ dài lần lƣợt là 1,77 Å và 2,19 Å. Dải DFG (bao gồm 3 amino acido Asp-Phe-Gly) có tính bảo tồn cao trong tất cả các thụ thể kinase, đóng vai trò quan trọng trong xúc tác protein, điều phối hƣớng liên kết với ATP thông qua ion Mg2+ [55]. Nên việc hình thành nhiều liên kết hydrogen với dải DFG cho thấy T-10 tƣơng tác tốt với EGFR-TK. Bên cạnh đó, T-10 hình thành nhiều tƣơng tác kị nƣớc với các amino acid Leu694, Val702, Lys721, Cys773 và Leu820. Vì vậy, T-10 có năng lƣợng tƣơng tác lớn (-11,59 kcal/mol) dù năng lƣợng quay tự docủa T-10 lớn trong các terpenoid (3,28 kcal/mol) nhƣng không ảnh hƣởng quá nhiều đến năng lƣợng liên kết của T-10. Dựa vào những điều trên, có thể thấy T-10 có tiềm năng nghiên cứu mở rộng trở thành chất ngăn chặn sự phát triển quá mức của thụ thể EGFR tyrosine kinase.
T-6 và T-8 đều có điểm chung là chỉ hình thành liên kết hydrogen với amino acid bản lề Met769. Tƣơng tác của 2 terpenoid này chủ yếu là tƣơng tác kị nƣớc với các amino acid nhƣ Val702, Ala719, Leu820. Nguyên nhân làm cho năng lƣợng liên kết của hai hợp chất này khá âm là do năng lƣợng quay tự do nhỏ ( 0,6 kcal/mol). Tuy nhiên, vì chúng vẫn có
liên kết hydrogen với amino acid bản lề, nên T-6 và T-8 cần nghiên cứu thêm.
Có năng lƣợng liên kết nhỏ nhất trong nhóm này là T-3. Quan sát Hình 3.4b cho thấy T-3 cũng hình thành những tƣơng tác tốt với các amino acid nhƣ Val702, Glu738, Met769, Asp831. Cũng nhƣ T-6 và T-8, năng lƣợng liên kết của T-10 khá âm là do năng lƣợng quay tự do nhỏ (1,76 kcal/mol). Nên T-3 cần nghiên cứu và mở rộng thêm về các nhóm thế gắn trên bộ khung.
Nhóm các chất có năng lƣợng liên kết trong phức với EGFR-TK cao hơn thuốc gồm: T-2, T-5, T-7, T-9 và T-11. Hình 3.5 là hình ảnh tƣơng tác của những hợp chất này trong thụ thể EGFR tyrosine kinase.
c) Tƣơng tác EGFR-TK/ T-7 d) Tƣơng tác EGFR-TK/ T-9
e) Tƣơng tác EGFR-TK/ T-11
Hình 3.5. Tƣơng tác của những hợp chất terpenoid có năng lƣợng liên kết lớn hơn so với thuốc Erlotinib.
Trong nhóm này, T-5 có năng lƣợng liên kết âm nhất. T-5 hình thành liên kết hydrogen với amino acid Cys751, Gln767 và Asp831. Việc hình thành liên kết với amino acid này chứng tỏ T-5 tiến sâu vào túi kị nƣớc, vì Cys751 nằm ở gần cuối của túi kị nƣớc. Đồng thời, các tƣơng tác kị nƣớc với amino acid: Ala719, Lys721 và Cys773 cho thấy T-5 tƣơng tác tốt với túi kị nƣớc chƣa ATP. Năng lƣợng liên kết của T-5 lớn hơn thuốc là do năng lƣợng quay của T-5 lớn (2,98 kcal/mol). Mặc dù vậy, nhƣng chúng tôi
vẫn đánh giá T-5 có nhiều tiềm năng phát triển thành hợp chất chống ung thƣ gây ra bởi EGFR-TK.
Các hợp chất T-2, T-7, T-9 có năng lƣợng liên kết với EGFR-TK gần bằng nhau. Nhìn hình 3.5, trong ba hợp chất thì T-2 có nhiều tƣơng tác nhất, chủ yếu là tƣơng tác kị nƣớc với amino acid: Leu694, Val702, Ala719, Lys721 và Leu820. T-2 chỉ hình thành liên kết hydrogen với Met769. Trong khi, T-7 chỉ hình thành liên kết hydrogen với Asp831 và tƣơng tác kị nƣớc với Lys721. T-9 thì không hình thành đƣợc liên kết hydrogen nào với amino acid vùng bản lề và dải DFG. Cả 3 hợp chất có năng lƣợng liên kết âm trên 7,00 kcal/mol, nguyên nhân là do năng lƣợng quay tự do nhỏ (1,79 kcal/mol). Nên không thể đánh giá T-2, T-3, T-9 có khả năng ức chế EGFR-TK, cần nghiên cứu và phát triển thêm.
Hợp chất T-11 có năng lƣợng quay tự do lớn nhất nhóm terpenoid. Nguyên nhân là do cấu trúc của T-11 linh động, khi tiến hành đƣa vào để nghiên cứu tƣơng tác với EGFR-TK, xuất hiện nhiều va chạm làm cho entronpy của hệ tăng, dẫn đến năng lƣợng tƣơng tác lớn. T-11 không có khả năng ức chế kém với tyrosine kinase EGFR.
3.2.3. Các hợp chất khác
Bảng 3.6 kể tên một số các hợp chất khác đƣợc phân lập từ cây Lá đắng
Bảng 3.6. Các hợp chất khác trong cây Lá đắng
STT
Tên gọi Kí hiệu KLPT (amu)
1 3, 5-bis 1,1 Dimethylethyl C-1 308,4
2 9, 12-Octadecadienoic acid C-2 280,4
4 Hexadecanoic C-4 255,4
5 Tetradecanoic acid C-5 228,4
Mô phỏng docking phân tử các hợp chất khác của cây Lá đắng với thụ thể EGFR-TK thu đƣợc kết quả về các loại năng lƣợng nhƣ trình bày trong Bảng 3.7
Bảng 3.7. Kết quả docking phân tử của các hợp chất khác với EGFR- TK (mã: 1M17) Hợp