Theo Qin & Kakimoto (2007) và kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học;
ZmDREB2A là nhân tố phiên mã nhóm DREB2 trong họ nhân tố phiên mã lớn AP2/ERF được phân lập từ cây ngô. Nghiên cứu ở mức protein ở ngô cho kết quả nhân tố phiên mã ZmDREB2A tồn tại ở hai dạng ZmDREB2A-L và ZmDREB2A- S. Gen mã hóa ZmDREB2A-L có kích thước 1283bp được lưu trong genebank với mã truy cập AB218833 và gen mã hóa ZmDREB2A-S có kích thước 1336bp được lưu trong genebank với mã truy cập AB218832. Gen mã hóa ZmDREB2A-L chứa thêm một đoạn chèn 53bp so với trình tự gen mã hóa ZmDREB2A-S.
Đánh giá sự biểu hiện của gen ZmDREB2A trên đối tượng cây ngô ở giai đoạn cây con bằng xử lý lạnh 4oC, hạn, xử lý mặn với nồng độ 250 mM NaCl và xử lý nhiệt 42oC cho kết quả cả 4 nhân tố này đều cảm ứng biểu hiện gen mã hóa
ZmDREB2A trong đó đáng chú ý là sự tích lũy mRNA của gen ZmDREB2A khá cao ở lá, thân, rễ; nhưng khi xử lý với axit Abscisic ngoại sinh thì không gây cảm ứng biểu hiện gen này. Thực nghiệm so sánh biểu hiện của cây Arabidopsis
chuyển gen ZmDREB2A và cây Arabidopsis không chuyển gen trong điều kiện hạn và nóng đã chứng minh vai trò quan trọng của gen ZmDREB2A trong việc cải thiện tính chống chịu của thực vật đối với hai yêu tố stress kể trên. Tỷ lệ cây sống sau giai đoạn xử lý hạn, khả năng phục hồi và trở lại sinh trưởng bình thường của các cây Arabidopsis chuyển gen ZmDREB2A cao hơn so với các cây Arabidopsis
không chuyển gen.
21
Mức độ biểu hiện mạnh của gen ZmDREB2A làm tăng cường biểu hiện các gen chức năng mã hóa các yếu tố như Protein LEA(late embryogenesis abundant). Trong đó thí nghiệm đánh giá chức năng gen ZmDREB2A trên đối tượng Arabidopsis cho thấy; khi được cảm ứng hạn và phân tích bằng kỹ thuật microarray cho thấy sự tích lũy các protein LEA ở cây chuyển gen tăng lên đáng kể so với đối chứng không chuyển gen (protein với mã số AT1G52690 tăng gấp 21.1 lần, AT3G15670 tăng 18 lần...). Hoặc mã hóa Protein sốc nhiệt (HSP). Ví dụ: cây arabidopsis chuyển gen ZmDREB2A được gây cảm ứng hạn, muối, lạnh và nhiệt đã tăng sự tích lũy các protein sốc nhiệt (protein với mã số AT1G52560 tăng gấp 18.6 lần, AT5G03720 tăng 14.2 lần, AT3G17790 tăng 7.5 lần, AT3G12580 tăng 7.1 lần) so với cây đối chứng không chuyển gen.
Như vậy nghiên cứu biểu hiện của gen ZmDREB2A trong cây arabidopsis
đã chứng minh được vai trò nâng cao tính chống chịu hạn, nóng và các yếu tố stress khác. Các cây arabidopsis chuyển gen ZmDREB2A có sức sống và khả năng sinh trưởng tốt hơn so với các cây arabidopsis không chuyển gen. Đây là cơ sở để các nhà khoa học sử dụng gen mã hóa nhân tố phiên mã ZmDREB2A cải biến di truyền trao đổi chất trên đối tượng cây ngô nhằm tăng cường tính chống chịu với điều kiện bất lợi nói chung và điều kiện hạn nói riêng.
Viện Nghiên cứu Ngô đã kết hợp với Viện Nghiên cứu Hệ gen đã phân lập, thiết kế vector và chuyển thành công gen chịu hạn ZmDREB2A vào 3 dòng ngô thuần Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Kết quả đã đánh giá sự có mặt và biểu hiện của các gen chuyển trong dòng ngô thông qua những phân tích phân tử như PCR, RT-PCR, sequencing. Các dòng có tỷ lệ cây mang gen cao, thể hiện khả năng chịu hạn vượt dòng nền đối chứng 7 -10% thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo và ổn định qua các thế hệ (Huỳnh Thị Minh Huệ & cs., 2014; Nguyễn Xuân Thắng & cs., 2016).
Các dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A được phát triển thông qua quá trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium có chứa vector pCAMBIA1300. Cấu trúc chuyển gen được thiết kế đưa vào vùng T-DNA của vector pCAMBIA1300 bao gồm đoạn Ubiquitin promoter, đoạn gen ZmDREB2A và đoạn 35S terminator.
Hình 3.4. Cấu trúc plasmid mang đoạn gen ubi::ZmDREB2A–S::35s.
22
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU