2.5.1. Vai trò của yếu tố phiên mã DREB
Nhóm nhân tố phiên mã DREB có một trung tâm hoạt động AP2/ERF duy nhất, trung tâm hoạt động này chứa 60-70 amino acid mang tính bảo thủ cao và không lặp lại trong vùng trình tự amino acid còn lại mã hóa nhân tố phiên mã này. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vùng trung tâm hoạt động AP2/ERF tương tác với vùng trình tự cis- đóng vai trò điều khiển biểu hiện gen liên quan đến phản ứng chống chịu của thực vật đối với điều kiện stress phi sinh học như:
Trình tự DRE (Dehydration responsive element) 5'-TACCGACAT-3': trình tự DRE điều khiển biểu hiện gen liên quan đến phản ứng chịu hạn và một số stress thẩm thấu khác trên cây Arabidopsis. Trình tự DRE được nhận biết đầu tiên trong cấu trúc promoter của gen đáp ứng với điều kiện hạn rd29A ở Arabidopsis.
Gen rd29A mã hóa protein có chức năng tương tự như các protein LEA (late embryogenesis abundant) giúp nâng cao tính chống chịu stress. Gen rd29A không được cảm ứng bởi stress thẩm thấu như hạn, mặn và điều kiện nhiệt độ thấp nhưng không cảm ứng với sự thay đổi nồng acid absicic (Saleh, 2003).
Trình tự CRT 5'-TGGCCGAC-3' (có chứa lõi 5'CCGAC-3') được nhận biết đầu tiên trong cấu trúc promoter của gen cảm ứng với nhiệt độ thấp trên cây
Arabidopsis và nhiều gen cảm ứng với điều kiện lạnh ở các đối tượng thực vật khác nhau như gen WCS120 ở lúa mì...(Saleh, 2003).
Trình tự DRE2 (5'-ACCGAC-3') được nhận biết đầu tiên trong cấu trúc promoter rab17 ở cây ngô, sự biểu hiện các gen được điều khiển bởi hoạt động của promoter này cảm ứng với điều kiện hạn và xử lý acid absisic ngoại sinh. (Saleh, 2003).
Ngoài ra nhân tố phiên mã này tham gia vào lộ trình phản ứng miễn dịch thực vật thông qua đường hướng Jasmonic acid (JA) và ethylen (ET) giúp tăng cường chống chịu các tác nhân gây bệnh nhóm necrotroph và cả tổn thương do
20
côn trùng. Nhân tố phiên mã DREB điều khiển biểu hiện gen cảm ứng bởi hai phytohormon này thông qua tương tác với trình tự ERE (Ethylene responsive element) 5-TAAGAGCCGCC-3' trong cấu trúc promoter cảm ứng với ethylen và tương tác với trình tự 5'-(T)TGAC(C/T)-3', 5'-AGACCGCC-3' trong cấu trúc promoter cảm ứng với Jasmonic acid (Saleh, 2003)
Cơ chế phản ứng chịu hạn diễn ra khá phức tạp, trong đó yếu tố phiên mã DREB đóng vai trò kích hoạt biểu hiện hàng loạt các gen đáp ứng với điều kiện hạn cũng như các yếu tố stress khác, giúp tăng cường tính chống chịu của cây đối với điều kiện ngoại cảnh. Hoạt động của gen AtDREB1A tăng cường tính chịu hạn và mặn ở lúa (Oh, Song & cs., 2005), OsDREB1A tăng cường tính chịu hạn, mặn và lạnh ở Arabidopsis (Dubouzet & cs., 2003), OsDREB2B tăng cường tính tính chịu hạn và nóng ở Arabidopsis (Matsukura & cs., 2010)...
2.5.2. Vai trò của gen ZmDREB2A trong quá trình hình thành phản ứngchịu hạn ở thực vật chịu hạn ở thực vật
Theo Qin & Kakimoto (2007) và kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học;
ZmDREB2A là nhân tố phiên mã nhóm DREB2 trong họ nhân tố phiên mã lớn AP2/ERF được phân lập từ cây ngô. Nghiên cứu ở mức protein ở ngô cho kết quả nhân tố phiên mã ZmDREB2A tồn tại ở hai dạng ZmDREB2A-L và ZmDREB2A- S. Gen mã hóa ZmDREB2A-L có kích thước 1283bp được lưu trong genebank với mã truy cập AB218833 và gen mã hóa ZmDREB2A-S có kích thước 1336bp được lưu trong genebank với mã truy cập AB218832. Gen mã hóa ZmDREB2A-L chứa thêm một đoạn chèn 53bp so với trình tự gen mã hóa ZmDREB2A-S.
Đánh giá sự biểu hiện của gen ZmDREB2A trên đối tượng cây ngô ở giai đoạn cây con bằng xử lý lạnh 4oC, hạn, xử lý mặn với nồng độ 250 mM NaCl và xử lý nhiệt 42oC cho kết quả cả 4 nhân tố này đều cảm ứng biểu hiện gen mã hóa
ZmDREB2A trong đó đáng chú ý là sự tích lũy mRNA của gen ZmDREB2A khá cao ở lá, thân, rễ; nhưng khi xử lý với axit Abscisic ngoại sinh thì không gây cảm ứng biểu hiện gen này. Thực nghiệm so sánh biểu hiện của cây Arabidopsis
chuyển gen ZmDREB2A và cây Arabidopsis không chuyển gen trong điều kiện hạn và nóng đã chứng minh vai trò quan trọng của gen ZmDREB2A trong việc cải thiện tính chống chịu của thực vật đối với hai yêu tố stress kể trên. Tỷ lệ cây sống sau giai đoạn xử lý hạn, khả năng phục hồi và trở lại sinh trưởng bình thường của các cây Arabidopsis chuyển gen ZmDREB2A cao hơn so với các cây Arabidopsis
không chuyển gen.
21
Mức độ biểu hiện mạnh của gen ZmDREB2A làm tăng cường biểu hiện các gen chức năng mã hóa các yếu tố như Protein LEA(late embryogenesis abundant). Trong đó thí nghiệm đánh giá chức năng gen ZmDREB2A trên đối tượng Arabidopsis cho thấy; khi được cảm ứng hạn và phân tích bằng kỹ thuật microarray cho thấy sự tích lũy các protein LEA ở cây chuyển gen tăng lên đáng kể so với đối chứng không chuyển gen (protein với mã số AT1G52690 tăng gấp 21.1 lần, AT3G15670 tăng 18 lần...). Hoặc mã hóa Protein sốc nhiệt (HSP). Ví dụ: cây arabidopsis chuyển gen ZmDREB2A được gây cảm ứng hạn, muối, lạnh và nhiệt đã tăng sự tích lũy các protein sốc nhiệt (protein với mã số AT1G52560 tăng gấp 18.6 lần, AT5G03720 tăng 14.2 lần, AT3G17790 tăng 7.5 lần, AT3G12580 tăng 7.1 lần) so với cây đối chứng không chuyển gen.
Như vậy nghiên cứu biểu hiện của gen ZmDREB2A trong cây arabidopsis
đã chứng minh được vai trò nâng cao tính chống chịu hạn, nóng và các yếu tố stress khác. Các cây arabidopsis chuyển gen ZmDREB2A có sức sống và khả năng sinh trưởng tốt hơn so với các cây arabidopsis không chuyển gen. Đây là cơ sở để các nhà khoa học sử dụng gen mã hóa nhân tố phiên mã ZmDREB2A cải biến di truyền trao đổi chất trên đối tượng cây ngô nhằm tăng cường tính chống chịu với điều kiện bất lợi nói chung và điều kiện hạn nói riêng.
Viện Nghiên cứu Ngô đã kết hợp với Viện Nghiên cứu Hệ gen đã phân lập, thiết kế vector và chuyển thành công gen chịu hạn ZmDREB2A vào 3 dòng ngô thuần Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Kết quả đã đánh giá sự có mặt và biểu hiện của các gen chuyển trong dòng ngô thông qua những phân tích phân tử như PCR, RT-PCR, sequencing. Các dòng có tỷ lệ cây mang gen cao, thể hiện khả năng chịu hạn vượt dòng nền đối chứng 7 -10% thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo và ổn định qua các thế hệ (Huỳnh Thị Minh Huệ & cs., 2014; Nguyễn Xuân Thắng & cs., 2016).
Các dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A được phát triển thông qua quá trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium có chứa vector pCAMBIA1300. Cấu trúc chuyển gen được thiết kế đưa vào vùng T-DNA của vector pCAMBIA1300 bao gồm đoạn Ubiquitin promoter, đoạn gen ZmDREB2A và đoạn 35S terminator.
Hình 3.4. Cấu trúc plasmid mang đoạn gen ubi::ZmDREB2A–S::35s.
22
PHẦN 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu bao gồm: 3 dòng ngô thuần mang gen chịu hạn ZmDREB2A (ở thế hệ T6) ký hiệu D3, D14 và D21. 3 sự kiện chuyển gen được tạo ra thông qua phương pháp chuyển gen sử dụng vi khuẩn Agrobacterium, Vector pCAMBIA1300 mang gen chịu hạn ZmDREB2A chuyển vào phôi non của 3 dòng ngô nền tương ứng có khả năng tái sinh cao là C436, C7N và V152. Các sự kiện đã được đánh giá bằng các kỹ thuật phân tử và chọn lọc qua các thế hệ thể hiện sự có mặt và biểu hiện ổn định của gen chuyển trong các dòng ngô. 12 THL được tạo ra từ thí nghiệm lai đỉnh giữa 3 dòng ngô chuyển gen và 3 dòng ngô nền với 2 cây thử là các dòng ngô thuần ưu tú NT6745 và H45.
Bảng 3.1. Danh sách các THL đỉnh tham gia thí nghiệm
TT Ký hiệu THL 1 D3xNT 2 D14xNT 3 D21xNT 4 C436xNT 5 C7NxNT 6 V152xNT 7 D3xH 8 D14xH 9 D21xH 10 C436xH 11 C7NxH 12 V152xH
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Đánh giá khả năng chịu hạn và một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng mang gen ZmDREB2A và dòng nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn cây con trong điều kiện nhà lưới.
Nội dung 2: Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng mang gen ZmDREB2A và dòng nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn trước trỗ trong điều kiện nhà lưới.
23
Nội dung 3: Đánh giá khả năng chịu hạn của các THL đỉnh mang sự kiện chuyển gen ZmDREB2A và THL nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo vụ Hè Thu 2019 tại Đan Phượng, Hà Nội.
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng chịu hạn và một số chỉ tiêu hóa sinh của các dòng mang gen ZmDREB2A và dòng nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn cây con trong điều kiện nhà lưới
* Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu hạn giai đoạn cây con: được tiến hành từ tháng 3 đến tháng 4 năm 2019, trong điều kiện nhà lưới với 3 lần nhắc và 2 công thức:
+ Công thức 1: Tưới nước đầy đủ
+ Công thức 2: Đến giai đoạn cây con 4-5 lá thì tiến hành thí nghiệm chịu hạn nhân tạo bằng cách không tưới nước trong 14 ngày, sau đó phục hồi trong 7 ngày (tưới nước đầy đủ).
Các dòng ngô được gieo trong chậu chứa giá thể xỉ than (có thể rút nước chủ động) đã tưới nước bão hòa, mỗi chậu gieo một dòng và gieo 10 hạt trên chậu. Các dòng ngô được tưới dung dịch dinh dưỡng đảm bảo cây sinh trưởng phát triển đồng đều. Tỉa bỏ các cây không đồng đều chỉ giữ lại 5 cây/chậu/dòng. Đến giai đoạn cây con 4-5 lá tiến hành thí nghiệm chịu hạn nhân tạo bằng cách không tưới nước liên tục trong 14 ngày. Tiến đánh giá đặc điểm hình thái và mức độ héo lá của các dòng ngô. Đối chứng là những dòng ngô không chuyển gen. Các chỉ tiêu theo dõi:
- Đánh giá mức độ héo lá được theo dõi: đánh giá mức độ héo của lá sau 5 ngày, 10 ngày và 14 ngày sau gây hạn.
- Đánh giá khả năng phục hồi và tỷ lệ sống sót của các dòng ngô trong điều kiện hạn 14 ngày và sau 7 ngày tưới nước phục hồi theo công thức:
Tỷ lệ cây sống (%) = (Số cây sống/ Tổng số cây xử lý)x100
- Các chỉ tiêu theo dõi liên quan đến khả năng chịu hạn của các dòng được đánh giá theo phương pháp của Camacho & Caraballo (1994).
+ Thể tích rễ (RV) được xác định bằng cách cho rễ vào ống đong, đổ nướớ́c ngập ghi thể tích ta có giá trị thể tích tổng (V(tổng)) sau đó vớt rễ ra ghi thể tích là thể tích nước V(nước), công thức tính thể tích rễ RV = V(tổng) - V (nước);
24
+ Chiều dài rễ dài nhất (LRL)(cm): đo từ đốt mang rễ đầu tiên đến rễ dài nhất;
+ Chiều cao cây (PH)(cm): đo từ đốt đầu tiên mang rễ đến lá dài nhất; + Khối lượng rễ tươi (RFW)(g), khối lượng thân tươi (SFW)(g); khối lượng rễ khô (RDW)(g); khối lượng thân khô (SDW)(g), tỷ lệ rễ khô/thân khô; tổng sinh khối khô (TMD) được cân bằng cân điện tử và độ chính xác 0,01g.
* Phương pháp đánh giá một số chỉ tiêu hóa sinh:
+ Quy trình phân tích hàm lượng Chlorophyll trong lá: Hút 10ml ethanol 96% vào ống falcon. Cắt một phần lá, định lượng khối lượng hoặc diện tích của phần lá đó rồi cho vào ống falcon chứaa ethanol. Cất giữ ống falcon chưa mẫu ở chỗ tối trong 24-48h. Đem dịch thu được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 665 và 649. Lượng chlorophyll trong mẫu lá đc tính theo công thức: Chl a = 13.70 x A665 – 5.76 x A649 (µg/ml); Chl b = 25.8 x A649 – 7.60 x A665 (µg/ml);
+ Quy trình phân tích đạm tổng số: Quy trình phân tích đạm theo phương pháp Kjeldahn (1883) có cải tiến. Phương pháp gồm 3 bước chính: Công phá mẫu (chuyển đạm từ dạng liên kết về dạng muốn amoni sunfate), chưng cất và chuẩn độ (tính hàm lượng đạm dựa trên số ion amonia có trong dung dịch nhận);
+ Phương pháp phân tích NSC (Ohnichi & Horie, 1999). Cân 0.5 g mẫu khô đã nghiền nhỏ cho vào ông falcon 50ml, thêm 30ml nước cất rồi đun ở 100o trong 60 phút. Sau khi để nguội thêm vào mỗi ống 20ml dung dịch Sodium
phosphate-phosphoric acid buffer. Đem lắc ở 200 vòng/phút ở nhiệt độ 40o trong 24h để NSC được phân hủy ra dung dịch. Mang mẫu lọc bằng giấy lọc rồi làm khô phần cặn thu được ở 135oC trong 4h. Cân lượng mẫu còn lại rồi tính lượng NSC theo CT: NSC (%) = (KL mẫu/KL mẫu sau sấy)/KL mẫu x 100;
+ Phương pháp phân tích proline tự do trong cây: Tiến hành nghiền 0,5g mẫu lá bằng nito lỏng rồi nghiền tiếp trong 10ml axit sulfosalicylic 3%. Sau đó lọc qua giấy lọc, bỏ cặn. Hút 2ml dung dịch mẫu cho phản ứng với 2ml axit axetic glacial và 2ml axit ninhydrin, phản ứng được thực hiện ở 100oC trong 1 giờ. Kết thúc phản ứng, hỗn hợp được làm lạnh trong khay đá. Thêm vào hỗn hợp phản ứng 4ml toluene, trộn đều bằng máy lắc vortex trong 15-20 giây. Sau khi hỗ hợp phản ứng bị tách làm 2 pha, hút pha lỏng phía trên (có màu hồng nhạt) và đo ở bước sóng 520nm. Dựa trên bước sóng đo được ở dãy proline chuẩn để tính lượng proline có trong mẫu.
25
Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng chịu hạn của các dòng mang gen ZmDREB2A và dòng nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo giai đoạn trước trỗ trong điều kiện nhà lưới
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2019, trong điều kiện nhà lưới tại Viện Nghiên cứu Ngô.
Phương pháp đánh giá khả năng chịu đoạn trước trỗ (CIMMYT, 2004; Cains & cs.,
hạn của các cây chuyển gen giai 2013).
Các dòng ngô được gieo trong xô chứa giá thể trong điều kiện nhà lưới. Sau khi cây ngô được 3 lá tiến hành tỉa bỏ các cây không đồng đều chỉ giữ lại 1 cây/xô/dòng, mỗi dòng 5 xô với hai công thức xử lý hạn và tưới nước đầy đủ. Các xô thí nghiệm được bón phân và tưới nước đồng đều ở mỗi xô để cây sinh trưởng phát triển bình thường cho đến thời điểm trước trỗ tiến hành ngừng tưới nhằm gây hạn nhân tạo đối với các dòng ngô trong công thức xử lý hạn, còn các dòng ngô trong không thức không xử lý hạn vẫn tưới nước đầy đủ. Thời gian xử lý hạn là 14 ngày. Sau 14 ngày gây hạn các xô thí nghiệm tưới nước trở lại để cây phát triển bình thường cho đến khi thu hoạch. Các chỉ tiêu theo dõi trong quá trình thí nghiệm gồm:
- Ngày trỗ cờ: Ngày có trên 75% số cây có hoa nở ở 1/3 trục chính - Ngày phun râu: Ngày có trên 75% số cây có râu nhú dài từ 2 đến 3cm -Ngày chín: Ngày có trên 75% cây có lá bi khô hoặc chân hạt có chấm đen. - Đánh giá độ cuộn của lá ngô: theo thang điểm từ 1-5: điểm 1: lá không cuộn, điểm 2: mép lá mới cuộn, điểm 3: mép lá cuộn hình chữ V, điểm 4: mép lá cuộn vào trong, điểm 5: lá cuộn tròn.
- Số lá thật: cắt đánh dấu lá thứ 5 và lá thứ 10 để tiện cho việc đếm tổng số lá cuối cùng
- Chiều cao cây: đo từ mặt xô thí nghiệm đến đốt phân nhánh cờ đầu tiên. - Chiều dài cờ: đo từ đốt phân nhánh cờ đầu tiên đến đỉnh của trục chính. - Số nhành cờ: đếm số nhánh cờ cấp 1
- Các yếu tố cấu thành năng xuất: chiều dài bắp, đường kính bắp, số hàng hạt, số hạt trên hàng, tỷ lệ khối lượng hạt/bắp, khối lượng 1000 hạt và năng suất của các dòng.
Năng suất (tạ/ha) (quy ra năng suất hạt ở độ ẩm 14%) 26
NSTT =
trong đó: P.ô: khối lượng bắp tươi/ô (kg) KE: tỷ lệ hạt tươi/bắp tươi (%)
Ao: độ ẩm hạt khi thu hoạch (%); S.ô: diện tích ô thí nghiệm (m2)
Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng chịu hạn của các THL đỉnh mang sự kiện chuyển gen ZmDREB2A và THL nền tương ứng thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo ngoài đồng ruộng.
Thí nghiệm được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2019, trong điều