PHẦN 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.5. GEN TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG CHỊU HẠN ZMDREB
2.5.1. Vai trò của yếu tố phiên mã DREB
Nhóm nhân tố phiên mã DREB có một trung tâm hoạt động AP2/ERF duy nhất, trung tâm hoạt động này chứa 60-70 amino acid mang tính bảo thủ cao và không lặp lại trong vùng trình tự amino acid còn lại mã hóa nhân tố phiên mã này. Nhiều nghiên cứu đã chứng minh vùng trung tâm hoạt động AP2/ERF tương tác với vùng trình tự cis- đóng vai trò điều khiển biểu hiện gen liên quan đến phản ứng chống chịu của thực vật đối với điều kiện stress phi sinh học như:
Trình tự DRE (Dehydration responsive element) 5'-TACCGACAT-3': trình tự DRE điều khiển biểu hiện gen liên quan đến phản ứng chịu hạn và một số stress thẩm thấu khác trên cây Arabidopsis. Trình tự DRE được nhận biết đầu tiên trong cấu trúc promoter của gen đáp ứng với điều kiện hạn rd29A ở
Arabidopsis. Gen rd29A mã hóa protein có chức năng tương tự như các protein
LEA (late embryogenesis abundant) giúp nâng cao tính chống chịu stress. Gen
rd29A không được cảm ứng bởi stress thẩm thấu như hạn, mặn và điều kiện nhiệt
độ thấp nhưng không cảm ứng với sự thay đổi nồng acid absicic (Saleh, 2003). Trình tự CRT 5'-TGGCCGAC-3' (có chứa lõi 5'CCGAC-3') được nhận biết đầu tiên trong cấu trúc promoter của gen cảm ứng với nhiệt độ thấp trên cây
Arabidopsis và nhiều gen cảm ứng với điều kiện lạnh ở các đối tượng thực vật khác nhau như gen WCS120 ở lúa mì...(Saleh, 2003).
Trình tự DRE2 (5'-ACCGAC-3') được nhận biết đầu tiên trong cấu trúc promoter rab17 ở cây ngô, sự biểu hiện các gen được điều khiển bởi hoạt động của promoter này cảm ứng với điều kiện hạn và xử lý acid absisic ngoại sinh. (Saleh, 2003).
Ngoài ra nhân tố phiên mã này tham gia vào lộ trình phản ứng miễn dịch thực vật thông qua đường hướng Jasmonic acid (JA) và ethylen (ET) giúp tăng cường chống chịu các tác nhân gây bệnh nhóm necrotroph và cả tổn thương do
côn trùng. Nhân tố phiên mã DREB điều khiển biểu hiện gen cảm ứng bởi hai phytohormon này thông qua tương tác với trình tự ERE (Ethylene responsive element) 5-TAAGAGCCGCC-3' trong cấu trúc promoter cảm ứng với ethylen và tương tác với trình tự 5'-(T)TGAC(C/T)-3', 5'-AGACCGCC-3' trong cấu trúc promoter cảm ứng với Jasmonic acid (Saleh, 2003)
Cơ chế phản ứng chịu hạn diễn ra khá phức tạp, trong đó yếu tố phiên mã DREB đóng vai trò kích hoạt biểu hiện hàng loạt các gen đáp ứng với điều kiện hạn cũng như các yếu tố stress khác, giúp tăng cường tính chống chịu của cây đối với điều kiện ngoại cảnh. Hoạt động của gen AtDREB1A tăng cường tính chịu hạn và mặn ở lúa (Oh, Song & cs., 2005), OsDREB1A tăng cường tính chịu hạn, mặn và lạnh ở Arabidopsis (Dubouzet & cs., 2003), OsDREB2B tăng cường tính tính chịu hạn và nóng ở Arabidopsis (Matsukura & cs., 2010)...
2.5.2. Vai trò của gen ZmDREB2A trong quá trình hình thành phản ứng chịu hạn ở thực vật chịu hạn ở thực vật
Theo Qin & Kakimoto (2007) và kết quả nghiên cứu của các nhà khoa học;
ZmDREB2A là nhân tố phiên mã nhóm DREB2 trong họ nhân tố phiên mã lớn AP2/ERF được phân lập từ cây ngô. Nghiên cứu ở mức protein ở ngô cho kết quả nhân tố phiên mã ZmDREB2A tồn tại ở hai dạng ZmDREB2A-L và ZmDREB2A- S. Gen mã hóa ZmDREB2A-L có kích thước 1283bp được lưu trong genebank với mã truy cập AB218833 và gen mã hóa ZmDREB2A-S có kích thước 1336bp được lưu trong genebank với mã truy cập AB218832. Gen mã hóa ZmDREB2A-L chứa thêm một đoạn chèn 53bp so với trình tự gen mã hóa ZmDREB2A-S.
Đánh giá sự biểu hiện của gen ZmDREB2A trên đối tượng cây ngô ở giai đoạn cây con bằng xử lý lạnh 4oC, hạn, xử lý mặn với nồng độ 250 mM NaCl và xử lý nhiệt 42oC cho kết quả cả 4 nhân tố này đều cảm ứng biểu hiện gen mã hóa
ZmDREB2A trong đó đáng chú ý là sự tích lũy mRNA của gen ZmDREB2A khá
cao ở lá, thân, rễ; nhưng khi xử lý với axit Abscisic ngoại sinh thì không gây cảm ứng biểu hiện gen này. Thực nghiệm so sánh biểu hiện của cây Arabidopsis
chuyển gen ZmDREB2A và cây Arabidopsis không chuyển gen trong điều kiện hạn và nóng đã chứng minh vai trò quan trọng của gen ZmDREB2A trong việc cải thiện tính chống chịu của thực vật đối với hai yêu tố stress kể trên. Tỷ lệ cây sống sau giai đoạn xử lý hạn, khả năng phục hồi và trở lại sinh trưởng bình thường của các cây Arabidopsis chuyển gen ZmDREB2A cao hơn so với các cây
Mức độ biểu hiện mạnh của gen ZmDREB2A làm tăng cường biểu hiện các gen chức năng mã hóa các yếu tố như Protein LEA(late embryogenesis abundant). Trong đó thí nghiệm đánh giá chức năng gen ZmDREB2A trên đối tượng Arabidopsis cho thấy; khi được cảm ứng hạn và phân tích bằng kỹ thuật microarray cho thấy sự tích lũy các protein LEA ở cây chuyển gen tăng lên đáng kể so với đối chứng không chuyển gen (protein với mã số AT1G52690 tăng gấp 21.1 lần, AT3G15670 tăng 18 lần...). Hoặc mã hóa Protein sốc nhiệt (HSP). Ví dụ: cây arabidopsis chuyển gen ZmDREB2A được gây cảm ứng hạn, muối, lạnh và nhiệt đã tăng sự tích lũy các protein sốc nhiệt (protein với mã số AT1G52560 tăng gấp 18.6 lần, AT5G03720 tăng 14.2 lần, AT3G17790 tăng 7.5 lần, AT3G12580 tăng 7.1 lần) so với cây đối chứng không chuyển gen.
Như vậy nghiên cứu biểu hiện của gen ZmDREB2A trong cây arabidopsis
đã chứng minh được vai trò nâng cao tính chống chịu hạn, nóng và các yếu tố stress khác. Các cây arabidopsis chuyển gen ZmDREB2A có sức sống và khả năng sinh trưởng tốt hơn so với các cây arabidopsis không chuyển gen. Đây là cơ sở để các nhà khoa học sử dụng gen mã hóa nhân tố phiên mã ZmDREB2A cải biến di truyền trao đổi chất trên đối tượng cây ngô nhằm tăng cường tính chống chịu với điều kiện bất lợi nói chung và điều kiện hạn nói riêng.
Viện Nghiên cứu Ngô đã kết hợp với Viện Nghiên cứu Hệ gen đã phân lập, thiết kế vector và chuyển thành công gen chịu hạn ZmDREB2A vào 3 dòng ngô thuần Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Kết quả đã đánh giá sự có mặt và biểu hiện của các gen chuyển trong dòng ngô thông qua những phân tích phân tử như PCR, RT-PCR, sequencing. Các dòng có tỷ lệ cây mang gen cao, thể hiện khả năng chịu hạn vượt dòng nền đối chứng 7-10% thông qua thí nghiệm gây hạn nhân tạo và ổn định qua các thế hệ (Huỳnh Thị Minh Huệ & cs., 2014; Nguyễn Xuân Thắng & cs., 2016).
Các dòng ngô chuyển gen ZmDREB2A được phát triển thông qua quá trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium có chứa vector pCAMBIA1300. Cấu trúc chuyển gen được thiết kế đưa vào vùng T-DNA của vector pCAMBIA1300 bao gồm đoạn Ubiquitin promoter, đoạn gen ZmDREB2A và đoạn 35S terminator.