2.2.1. Một số phương pháp xác định chỉ tiêu hoá lý
a. Xác định độ ẩm trong mẫu bột nguyên liệu khô bằng cách làm mất khối lượng do làm khô (Phụ lục 9.6 – DĐVN IV) [3]
Dùng dụng cụ sấy bằng thuỷ tinh rộng miệng, đáy bằng có nắp mài làm bì đựng mẫu thử; làm khô bì trong thời gian 30 phút theo phương pháp và điều kiê ̣n quy đi ̣nh trong chuyên luận rồi cân để xác đi ̣nh khối lượng bì. Cân ngay vào bì này mô ̣t lượng chính xác
18 mẫu thử bằ ng khối lượng quy đi ̣nh trong chuyên luâ ̣n với sai số ± 10 %. Nếu không có chỉ dẫn gì đă ̣c biê ̣t thì lượng mẫu thử được dàn mỏng thành lớp có đô ̣ dày không quá 5 mm. Tiến hành làm khô trong điều kiê ̣n quy đi ̣nh của chuyên luâ ̣n. Nếu dùng phương pháp sấ y thì nhiê ̣t đô ̣ thực cho phép chênh lê ̣ch ±2 oC so với nhiê ̣t đô ̣ quy đi ̣nh. Sau khi sấy phải làm nguội tới nhiê ̣t đô ̣ phòng, trong bình hút ẩm có silicagel rồi cân ngay. Nếu chuyên luâ ̣n không quy đi ̣nh thời gian làm khô có nghĩa là phải làm khô đến khối lượng không đổi, tức là sự chênh lê ̣ch khối lượng sau khi sấy thêm 1 giờ trong tủ sấy hoă ̣c 6 giờ trong bình hút ẩm so với lần sấy trước đó không quá 0,5 mg. Xác định mất khối lượng do làm khô theo công thức:
W(%) =mmẫu- mmẫu sau làm khô
mmẫu × 100%
b. Xác định hàm lượng kim loại nặng trong mẫu lá mơ lông tươi bằng phương pháp phổ hấp thu nguyên tử [3]
Mẫu lá mơ sau khi tro hoá được hoà tan bằng dung dịch HNO3, đặc 65-68% và định mức đến 250 ml. Lấy dung dịch đã định mức trên để xác định hàm lượng một số kim loại nặng là Pb, Cu, Zn, As bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (sử dụng kỹ thuật ngọn lửa đối với Pb, Cu, Zn (TCVN 6193:1996) và kỹ thuật hóa hơi đối với As (TCVN 6826:2000)).
Công thức chuyển đổi từ hàm lượng mg/l sang hàm lượng mg/kg như sau: C(mg/kg)= Cmg/l
m0 x 250
Trong đó, mo là khối lượng mẫu lá mơ trước khi tro hóa.
2.2.2. Phương pháp định tính một số thành phần hoá học trong nguyên liệu [3,4,6]
a. Alkaloid
Cân 5 – 10g nguyên liệu (đã nghiền) ngâm 24h trong dung môi chloroform + ethanol 950C + NH4OH (8:8:1). Sau đó, lọc thu cặn, dùng cặn hòa tan trong HCl (đun ấm) rồi lọc bỏ cặn chỉ lấy dịch lọc. Thử với 3 loại thuốc thử sau:
- Thuốc thử Mayer
Thuốc thử Mayer: Hoà tan 1.36g HgCl2 trong 60mL nước cất và hoà tan 5g KI trong 10mL nước cất. Hỗn hợp hai dung dich và thêm nước cất cho đủ 100mL.
19 Nhỏ vài giọt thuốc thử Mayer vào dung dịch vừa thu được, nếu có alkaloid sẽ có hiện tượng kết tủa dạng vô định hình (bông trắng). Cần lưu ý vì tủa tạo thành sẽ có thể hoà tan trở lại trong lượng thừa thuốc thử hoặc hoà tan bởi methanol có sẵn trong dịch lọc.
- Thuốc thử Wagner
Thuốc thử Wagner: Hoà tan 1.27g I2 và 2g KI trong 20mL nước cất. Thêm nước cho đủ 10mL.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Wagner vào dung dịch vừa thu được, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu.
- Thuốc thử Dragendroff
Thuốc thử Dragendroff: Hoà tan 8g Nitrat bismuth Bi(NO3)3.H2O trong 25mL HNO3 30% (d=1,18). Hoà tan 28g KI và 1mL HCl 6N trong 5mL nước cất. Hỗn hợp 2 dung dịch, để yên trong tủ lạnh 50C cho tủa màu sậm và tan trở lại, lọc và thêm nước cho đủ 100mL. Dung dịch màu cam – đỏ được chứa trong chai màu nâu để che ánh sáng, cất trong tủ lạnh, có thể giữ lâu được vài tuần.
Nhỏ vài giọt thuốc thử Dragendroff vào dung dịch vừa thu được, nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu cam hoặc đỏ.
b. Flavonoid
Cân 5g nguyên liệu (đã nghiền) ngâm 24h trong ethanol. Sau đó lọc lấy dịch. Dịch lọc sau khi thu, thử với 2 loại:
- Nhỏ vài giọt H2SO4 đậm đặc vào dịch lọc, nếu có Flavonoid thì + Flavon và flavonol cho màu vàng đậm đến màu cam + Chalcon, Auron cho màu đỏ hoặc xanh dương – đỏ + Flavanon cho màu từ cam đến đỏ
- Nhỏ dung dịch NaOH 1% vào dịch lọc, nếu có Flavonoid thì cho màu từ vàng đến cam – đỏ.
c. Coumarine
Cân 5g nguyên liệu (đã nghiền) ngâm 24h trong ethanol, sau đó lọc lấy dịch. Chuẩn bị 2 ống nghiệm:
20
- Ống 2: dùng để so sánh.
Đem đi đun cách thủy khoảng 2 phút + 4mL nước cất (lúc này ống 1 trong hơn ống 2). Thêm H2SO4 loãng, nếu ống 1 có màu đục hơn thì xác định có Coumarine.
d. Saponin
Cân 5g nguyên liệu (đã nghiền) và ngâm 24h trong ethanol, sau đó đun cách thủy 5 phút và lọc lấy dịch.
Chuẩn bị 2 ống nghiệm: 5mL HCl 0,1N + 3 giọt dịch lọc (ống 1), 5mL NaOH 0,1N + 3 giọt dịch lọc (ống 2). Đậy lại và lắc mạnh khoảng 1 phút, quan sát hiện tượng tạo bọt (phổ bọt) trong cả hai ống nghiệm.
Nếu bọt cao bằng nhau, có thể có Saponin tritecpenoid. Nếu bọt ống 2 cao hơn ống 1, có thể có Saponin seteroid.
e. Đường khử
Cân 5g nguyên liệu (đã nghiền) ngâm 24h trong ethanol, sau đó lọc lấy dịch.
Fehling A: Hoà tan 40g CuSO4.5H2O vào nước cất trong bình định mức dung tích
1000ml, trộn đều và thêm nước đến vạch.
Fehling B: Hoà tan 200g Kali natri tartrat ngậm bốn phân tử nước
(KNaC4H4O6.4H2O) vào 500mL đến 600mL nước cất trong bình định mức dung tích 1000mL. Hoà tan 150g NaOH trong 200mL đến 300mL nước cất, chuyển vào bình định mức 1000mL chứa Kali natri tartrat (KNaC4H4O6.4H2O).
Cho dịch lọc vào ống nghiệm thêm 5 giọt fehling A và 5 giọt fehling B, đun cách thủy 5 – 10 phút. Nếu có đường khử thì xuất hiện kết tủa đỏ gạch.
f. Polyphenol
Cân 5g nguyên liệu (đã nghiền) ngâm 24h trong ethanol hoặc methanol, sau đó lọc lấy dịch. Cho dịch lọc vào ống nghiệm thêm FeCl3 1%. Nếu có Polyphenol thì xuất hiện màu xanh thẫm.
g. Steroid
Cân 5g nguyên liệu (đã nghiền) ngâm 24h trong chloroform. Sau đó thu dịch lọc. Thử bằng 2 phản ứng:
21 - Phản ứng Libermann – Burchard: Lấy 1mL anhydric acetic + 1mL chloform vào ống nghiệm (làm lạnh), sau đó cho dịch lọc vào. Nếu có Steroid thì có màu xanh dương (lục, cam, đỏ) bền màu.
- Phản ứng Salkouski: Cho dịch lọc vào ống nghiệm thêm H2SO4 đậm đặc dung dịch có màu đỏ đậm hoặc xanh.
h. Acid hữu cơ
Cân 5g nguyên liệu cho vào 10mL nước cất đun sôi trong 10 phút, để nguội rồi thu dịch lọc. Dùng 2mL dịch lọc thêm một ít tinh thể Na2CO3, nếu xuất hiện hiện tượng sủi bọt khí thì có thể có axit hữu cơ.
i. Chất béo
Cân 5g nguyên liệu (đã nghiền) và ngâm 24h trong hexanE, sau đó lọc lấy dịch. Nhỏ vài giọt dịch lọc lên giấy lọc (giấy lọc A4), sấy nhẹ, nếu xuất hiện vết mờ ngay chỗ nhỏ giọt thì có chất béo.
k. Carotene
Cân 5g nguyên liệu ngâm 24h trong n-hexan, sau đó lọc thu dịch. Lấy 2ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, đun cách thủy và lọc thu cặn. Thêm vào giọt H2SO4 đậm đặc, nếu xuất hiện màu xanh lá thì có thể có Carotene.