L ời cảm ơn
2.4.3. ổn định của kháng nguyên LMLM
Cấu tạo toàn bộ vi rút lở mồm long móng chứa bốn loại hạt: (i) hạt vi rút 146S, bao gồm một phân tử ARN sợi đơn và 60 bản sao của bốn loại polypeptide VP1, VP2, VP3 và VP4; (ii) các hạt rỗng 75S, không có RNA và bao gồm 60 bản sao của mỗi VP1, VP3 và VP0 (tiền thân của VP2 và VP4); (iii) tiểu đơn vị 12S bao gồm năm bản sao (pentamer) của VP1, VP2 và VP3 nhưng không có VP4; và (iv) liên quan đến kháng nguyên (VIA) với hệ số sa lắng trong sucrose gradient là 3.5S.
Cơ thể sản sinh ra kháng thể trung hòa chủ yếu liên quan đến các hạt 146S, hạt 12S được tạo ra khi hạt 146S bị phá vỡ bởi a xít yếu hoặc làm nóng ở 56°C.
Kháng nguyên 12S có thể được coi là kháng nguyên tiền điện tử, nên kháng thể trung hòa trong huyết thanh được tạo ra từ các hạt 12S là thấp và không có ý nghĩa. Còn các hạt vi rút 75S được chứng minh là ổn định khi bất hoạt bằng AEI. Ở 40C, chúng ổn định ít nhất 2 năm. Đặc tính của các hạt 75S cũng tương tự hạt 146S, có khả năng tạo ra kháng thể trung hòa nhưng kháng thể tạo ra thấp hơn kháng thể tạo ra từ hạt 146S. Nồng độ của kháng nguyên (tính bằng µg/ml) là phương pháp gián tiếp để xác định thời gian miễn dịch và khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể. Các hạt 146S được coi là thành phần miễn dịch chính của vi rút LMLM và bất kỳ yếu tố nào ảnh hưởng đến các hạt 146S đều có thể làm giảm hiệu lực của vắc xin. Theo M.M. Harmsen và cộng sự năm 2015, sự ổn định của 146S được kéo dài trong vòng 3 tháng bằng cách bổ sung đường và BSA bảo quản dưới dạng vắc xin nhũ dầu (Harmsen & cs., 2015).
Để xác định hàm lượng 146S, người ta sử dụng nhiều phương pháp. Phương pháp sucrose gradient cho kết quả nhanh chóng, nhưng lại đòi hỏi phải có thiết bị đắt tiền và cũng không phân biệt được hạt 146S còn nguyên vẹn và hạt 146S đã bị cắt bởi trysin (Van Maanen & Terpstra, 1990). Năm 1984, Ouldridge cùng cộng sự đã giới thiệu một phương pháp xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết với enzyme sandwich (ELISA) để định lượng cụ thể hàm lượng 146S trong thu hoạch vi rút vắc xin và chỉ định lượng 146S, mà không phát hiện ra kháng nguyên 12S. Tuy nhiên, có nghiên cứu lại cho kết quả trái ngược, phương pháp này định lượng 146S cũng giống như 12S, nên không phù hợp để xác định hàm lượng toàn bộ vi rút. Do đó, chỉ xác định hàm lượng 146S, đã có nghiên cứu thử nghiệm phương pháp ELISA có sử dụng kháng thể kép (DAS) và đã được mô tả mối tương quan với phương pháp sucrose gradient (Van Maanen & Terpstra, 1990).
2.4.4. Các phương pháp đánh giá đáp ứng miễn dịch của động vật khi tiêm vắc xin LMLM
Hiện nay, để đánh giá đáp ứng miễn dịch hay hiệu quả sử dụng vắc xin dùng cho động vật, người ta sử dụng rất nhiều các phương pháp đánh giá; đánh giá trực tiếp khả năng kháng vi rút của động vật (phương pháp công cường độc) hoặc gián tiếp đánh giá hiệu giá kháng thể của động vật sau khi tiêm chủng.
Liều PD50 (protective dose 50) là liều bảo hộ 50% động vật thí nghiệm được tiêm vắc xin với các liều khác nhau sau khi thử thách công cường độc. Hiệu
lực của vắc xin biểu diễn số lượng liều PD50 (Oie, 2018). Ngày nay, liều PD50 trên bê được ước tính bằng cách sử dụng động vật thí nghiệm là bê ít nhất 6 tháng tuổi chưa được tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM. Bê được tiêm các liều vắc xin khác nhau (1/4, 1/8, 1/10...) với mỗi nồng độ ít nhất 5 con. Sau 3 tuần tiêm vắc xin, nhóm động vật được tiêm và nhóm đối chứng (2 con) được thử thách bằng vi rút công cường độc. Theo dõi động vật trong vòng 8 ngày và quan sát triệu chứng, bệnh tích của các nhóm. Từ số lượng động vật được bảo vệ mà tính toán liều PD50 theo công thức Karber. Vắc xin dự phòng thông thường nên chứa ít nhất 3 PD50, một số trường hợp có thể sử dụng 6 PD50. Tương tự đối với lợn, liều PD50 cũng được tính toán theo phương pháp trên. Liều PD50 có mối quan hệ với hàm lượng 146S xác định trong một liều vắc xin. Hàm lượng 146S yêu cầu để đạt được 1 PD50 là 2,2 µg/serotype/liều, mặc dù có thể quan sát thấy khả năng bảo hộ ở nồng độ kháng nguyên thấp hơn (Daoud & cs., 2013).
Các xét nghiệm gián tiếp là đánh giá hiệu giá kháng thể của động vật sau tiêm bằng phương pháp phản ứng trung hòa vi rút trên môi trường tế bào (VNT) hoặc phương pháp ELISA phát hiện kháng thể, hoặc phương pháp LPB- ELISA định lượng kháng thể, hay liều bảo hộ của vắc xin trên chuột lang chưa cai sữa (Maradei & cs., 2008). Dựa trên kết quả xét nghiệm các mẫu huyết thanh, sẽ xây dựng được mối tương quan với hiệu lực của vắc xin đánh giá trên gia súc.
Đánh giá hiệu quả phòng bệnh của vắc xin LMLM chỉ dựa vào giá trị tương đồng kháng nguyên là chưa thật sự chính xác (Trần Xuân Hạnh, 2020). Có nhiều thí nghiệm chứng minh giá trị r1 thấp không phải lúc nào cũng tương ứng với khả năng bảo hộ của vắc xin thấp. Ví dụ: vắc xin LMLM với hiệu lực > 6PD50 có thể tạo ra sự bảo hộ ngay cả với vi rút dị chủng có giá trị r1 thấp (Trần Xuân Hạnh, 2020). Ở chiều ngược lại, giá trị r1 giữa chủng O1 Manisa và O1 Campos khá cao (r1 = 0,64), có nghĩa là 2 chủng vi rút này có tính tương đồng về kháng nguyên. Gây miễn dịch cho động vật bằng tiêm vắc xin chứa 3,75 µg/ liều. Kết quả công cường độc đồng chủng với O1 Manisa bảo hộ 100%. Kết quả công cường độ dị chủng với O1 Campos chỉ có tỷ lệ bảo hộ 28,6% đến 60%. Chỉ khi động vật được gây miễn dịch với vắc xin có nồng độ kháng nguyên cao (60 µg/ liều) tỷ lệ bảo hộ mới tăng cao từ 75% đến 100% khi công cường độc với chủng virus dị chủng (Trần Xuân Hạnh, 2020). Theo nghiên cứu của Boehringer Ingelheim “chỉ số tin cậy” nên được dùng để đánh giá hiệu của của vắc xin. “Chỉ
số tin cậy” (bảng 2.3) là kết hợp giữa giá trị r1 và hiệu giá trung hòa vi rút dị chủng (Trần Xuân Hạnh, 2020).
Bảng 2.3. Chỉ số tin cậy trong đánh giá hiệu quả vắc xin
TT Chỉ tiêu đánh giá Khảnăng bảo hộ
1 Giá trịr1 ≥ 0,3 & HGKT* trung hòa ≥ 1,42 Có khảnăng bảo hộ cao 2 Giá trịr1 < 0,3 & HGKT trung hòa ≥ 1,42 Có thể bảo hộ
3 Giá trịr1 ≥ 0,3 & HGKT trung hòa < 1,42 Khó dựđoán
4 Giá trị r1 < 0,3 & HGKT trung hòa < 1,42 Không thể bảo hộ
* log 10 hiệu giá kháng thể trung hòa (HGKT)