L ời cảm ơn
3.2. Địa điểm nghiên cứu
- Nghiên cứu được thực hiện tại công ty TNHH MTV Avac Việt Nam
3.3. NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU
3.3.1. Chủng giống vi sinh, động vật thử nghiệm
- Chủng sản xuất vắc xin vô hoạt phòng bệnh lở mồm long móng: chủng vi rút O/FMD/Avac3 là sản phẩm của đề tài nghiên cứu chọn chủng vi rút LMLM (báo cáo của công ty RTD kèm theo Công văn số 30.10/2016/BC-RTD).
- Chủng giống vi rút lựa chọn thuộc nhóm O/ME –SA/Panasia: O manisa, O/VN/ HN1/2013, O/VN/HT1/2015; nhóm O Cathay: O/VIT/9/2008; nhóm O /SEA-Mya98: O/VIT/5/2010; nhóm O/ME-SA/Ind2001: O/pig/Daklak/15. Thông tin một số chủng dùng làm phản ứng trung hoà chéo trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Nguồn gốc các vi rút được chọn đểđánh giá chọn giống
STT Tên chủng giống Địa phương Năm
phân lập Động vật Topotype
1 O manisa Vi rút được chọn có thành phẩn kháng nguyên tương đồng với chủng vi rút LMLM lưu hành ở Việt Nam
2 O/ VN/HN1/2013 Sơn Tây- Hà Nội 2013 Lợn ME –
SA/PanAsia 3 O/VN/HT1/2015 Kỳ Anh- Hà Tĩnh 2015 Bê ME-
SA/PanAsia 4 O/FMD/Avac3 Bảo Lộc –Lâm Đồng 2015 Bò ME – SA/PanAsia 5 O/pig/Daklak/15 Đắk Lắk Không có
thông tin Lợn ME-
SA/Ind2001 6 O/VIT/9/2008 Tp. Hồ Chí Minh 2008 Lợn Cathay 7 O/VIT/5/2010 Hà Tĩnh 2010 Lợn SEA- Mya98
- Động vật thí nghiệm: lợn 4 - 5 tuần tuổi chưa tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể kháng virus LMLM
- Tế bào BHK21 (Baby Hamster Kidney) dạng bám đáy.
3.3.2. Hóa chất
- Hóa chất và sính phẩm nuôi cấy tế bào: DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), FBS (Fetal Bovine serum), TV 1x (Trypsin versene), PBS (Phosphate Buffered Saline), Penicillin/ Streptomycin.
- Hóa chất dùng để vô hoạt, nhũ hóa: BEI (Binary Ethylenimine), Na2S2O3 (Sodium thiosulfate), ISA 201 VG, keo phèn nhôm Al(OH)3, Saponin.
- Môi trường kiểm tra vô trùng:TSB (Trypticase Soybean), TSA (trypticase soy agar), SD (sabouraud dextrose agar), XLD (Xylose Lysine Deoxycholate), FTM (fruid thioglycolate), thạch máu.
- Hóa chất sử dụng cho phương pháp LPB - ELISA: theo bộ kít Liquid Phase Blocking ELISA (LPBE) for Detection FMDV Antibody Test Kit, Pirbright, UK bao gồm có: coating buffer, tween 20, skim milk, OPD (o- Phenylenediamine), TMB (Tetramethyl benzidine), citric acid, H2SO4, rabbit antiserum, guinea-pig antiserum, rabbit anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP, huyết thanh đối chứng dương, huyết thanh đối chứng âm.
3.3.3. Trang thiết bị, dụng cụ
- Phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp 3, nhà thử nghiệm động vật
- Phòng nuôi cấy tế bào, vi rút và các thiết bị an toàn sinh học khác: tủ ấm CO2, tủ lạnh 2 – 80 C, tủ âm 800 C, cân phân tích, máy đo pH, máy đọc ELISA, máy lắc, pipet điện, máy tạo nhũ, máy lọc tiếp tuyến.
- Dụng cụ: đầu típ các loại (10 µl, 50 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl), đĩa ELISA, chai tế bào các loại: T25, T75, chai 10 tầng.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4.1. Giám định đặc tính di truyền của vi rút vắc xin
- Giải mã gen VP1
- Phân tích tương đồng trình tự gen và xây dựng cây phả hệ
3.4.2. Khả năng sản sinh đáp ứng miễn dịchcủa vắc xin LMLM chủng O3
- Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm một mũi vắc xin - Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm hai mũi vắc xin
3.4.3. Ảnh hưởng của chất bổ trợ tới đáp ứng miễn dịch
- Đáp ứng miễn dịch của lợn khi tiêm vắc xin LMLM vô hoạt keo phèn - So sánh đáp ứng miễn dịch ở lợn tiêm vắc xin nhũ dầu và keo phèn bằng phản ứng trung hòa và phản ứng LPB- ELISA
3.4.4. Khả năng bảo hộ chéo đối với chủng vi rút thực địa
- Mức tương đồng kháng nguyên với chủng vi rút thuộc topotype ME-SA - Mức tương đồng kháng nguyên với các topotype O lưu hành ở Việt Nam
3.4.5. Độ dài miễn dịch tạo ra bởi vắc xin LMLM chủng O3
- Xác định độ dài miễn dịch bằng phản ứng trung hòa - Xác định độ dài miễn dịch bằng phản ứng LPB- ELISA
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Phương pháp nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút
Tế bào dòng được nuôi cấy trên môi trường DMEM, bổ sung 10% huyết thanh bào thai bò (FBS) như sau:
Khi tế bào BHK21 phát triển phủ kín đáy chai nuôi cấy (thường sau 48 giờ nuôi cấy). Sau đó, tách tế bào bằng Trypsin 1x. Khi tế bào co và bong ra, bổ sung DMEM 1x trung hòa trypsin, chuyển sang ống ly tâm, thu cặn tế bào. Hoàn nguyên tế bào bằng dung dịch DMEM 1x, đếm số tế bào và tính toán nồng độ ra chai tế bào.
Chuẩn độ vi rút và trung hòa tế bào theo quy trình dùng đĩa 96 giếng và 50000 tế bào/giếng. Phương pháp gây nhiễm tế bào: gây nhiễm vi rút để chuẩn bị sản xuất kháng nguyên trên chai 10 tầng. Gây nhiễm 20 ml giống vi rút cho chai 10 tầng, ủ 60 phút/ 370C/thêm môi trường duy trì DMEM, nuôi cấy trong tủ ấm 370 C có 5% C02. Theo dõi bệnh tích tế bào. Sau khi bệnh tích đạt trên 80% thì thu hoạch huyễn dịch. Thường thu hoạch kháng nguyên từ 18 – 24 giờ sau gây nhiễm.
3.5.2. Phương pháp chuẩn độ vi rút và trung hòa vi rút trên tế bào
3.5.2.1. Phương pháp chuẩn độ vi rút
Xác định chỉ số TCID50 (liều tại đó gây chết 50% giếng tế bào mà có CPE) bằng phương pháp chuẩn độ vi rút trên tế bào dạng treo, tính toán theo Spearman và Karber như sau: Log TCID50 = X0 - d/2 + d x ri/ni
Trong đó: X0: nồng độ pha loãng cao nhất mà tại đó tế bào có bệnh tích là 100%; d: khoảng cách pha loãng; ri: tổng giếng tế bào có bệnh tích từ nồng độ X0; ni: số giếng tế bào gây nhiễm ở mỗi nồng độ.
Vi rút LMLM được pha loãng theo cơ số 10 (từ 10-1 đến 10-8) trong môi trường DMEM. Trên đĩa 96 giếng, cho 100 µl huyễn dịch vi rút vào các giếng tương ứng. Cho 100 µl tế bào, lắc nhẹ, ủ đĩa và theo dõi trong 2 ngày. Đọc kết quả ghi số giếng có CPE, tính TCID50 theo công thức.
3.5.2.2. Phương pháp trung hòa vi rút trên nuôi cấy tế bào (VNT)
Theo hướng dẫn của OIE (Oie, 2018) trung hòa vi rút trên nuôi cấy tế bào sử dụng dung dịch tế bào BHK21 dạng treo. Quá trình thực hiện trên đĩa nuôi cấy 96 giếng, nồng độ tế bào là 50000 tế bào/giếng.
Vi rút LMLM O/FMD/Avac3 được pha loãng trong dung dịch DMEM, lấy nồng độ trung hòa là 100 TCID50/giếng. Huyết thanh 0, 28 và 56 ngày được diệt bổ thể ở 560C/30 phút; pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 từ 1/8 đến 1/512. Mỗi bậc pha loãng huyết thanh được lặp lại 2 lần (2 giếng). Vi rút trộn với huyết thanh theo tỷ lệ 1 : 1 (50 µl : 50 µl), ủ 370C/60 phút rồi thêm 50 µl tế bào đạt nồng độ 50000 tế bào/giếng vào, đem nuôi ở tủ ấm 370C /5% CO2. Theo dõi bệnh tích tế bào, sau 2 ngày đọc kết quả. Đọc kết quả theo hướng dẫn của OIE: dương tính (+): tế bào ở giếng phản ứng không bị phá hủy, âm tinh (-): tế bào ở giếng phản ứng bị phá hủy, bong khỏi đáy giếng, để lại khoảng trống. Hiệu giá trung hòa 50% được tính theo phương pháp Spearman-Karber: LogVNT50 = Xo + d/2 - d∑ri/ni
Trong đó: Xo là Log10 của nghịch đảo độ pha loãng huyết thanh cao nhất; d: log10 của khoảng cách pha loãng; r: tổng số giếng dương tính; n: số giếng cho một độ pha loãng
Đọc kết quả: (i) âm tính nếu log10 VNT50 ≤ 1,21 (1/16); (ii) dương tính nếu log10 VNT50 ≥ 1,65 (1/45); (iii) nghi ngờ nếu log10 VNT50 trong khoảng 1,21 (1/16) đến 1,5 (1/32). Phản ứng thử được xem xét lặp lại nếu kết quả lặp lại cao hơn 1,21 (1/16) được xem là dương tính, ngược lại là âm tính.
Theo TCVN 8685 -10: 2014 (Tiêu Chuẩn Quốc Gia 8685, 2014) vắc xin đạt tiêu chuẩn khi hiệu giá kháng thể trung hòa vi rút là 1/100 (khi vắc xin có tính tương đồng kháng nguyên).
Đánh giá tính tương đồng kháng nguyên giữa các vi rút vắc xin và vi rút thực địa theo phương pháp tính tương quan r1 (Serological relationship: r1 – value). Công thức tính giá trị r1:
r1 = Hiệu giá kháng thể của huyết thanh do vắc xin trung hoà với vi rút Hiệu giá kháng thể của huyết thanh do vắc xin trung hoà với vi rút vắc xin Giá trị r1 ≥ 0,3 được xem như vi rút vắc xin có tương đồng kháng nguyên với vi rút thực địa.
Giá trị r1 < 0,3 được xem như vi rút vắc xin không tương đồng kháng nguyên với vi rút thực địa.
3.5.3. Phương pháp cô đặc, vô hoạt, phối trộn với chất bổ trợ và kiểm tra vắc xin khi phối trộn vắc xin khi phối trộn
3.5.3.1. Phương pháp vô hoạt vi rút bằng BEI
- Vi rút LMLM thu hoạch từ môi trường sau gây nhiễm trên tế bào BHK21 được lọc, cô đặc và vô hoạt bằng BEI (Binary ethylenimine) theo khuyến cáo của OIE như sau (Oie, 2018):
+ Vô hoạt vi rút tại nồng độ 1mM BEI /ml kháng nguyên trong 24 giờ tại 37 0C.
+ Sau 24 giờ vô hoạt, trung hòa lượng BEI tồn dư bằng dung dịch Na- thiosulphate (Na2S2O3) trong 2 giờ tại 370C.
+ Thu hoạch vi rút và kiểm tra vi rút sau vô hoạt bằng phương pháp nuôi cấy lại huyễn dịch vi rút sau vô hoạt trên môi trường tế bào BHK21.
Kiểm tra vô hoạt vi rút: nuôi cấy và cấy chuyển 3 lần liên tiếp huyễn dịch vi rút đã vô hoạt trên môi trường tế bào BHK21. Vi rút được đánh giá là vô hoạt đạt yêu cầu nếu sau 3 lần cấy chuyển liên tiếp, không thấy bệnh tích trên chai nuôi cấy tế bào BHK21 sau 3 ngày theo dõi. Quá trình thực hiện trên chai tế bào T25, lượng huyễn dịch vi rút gây nhiễm là 1ml.
3.5.3.2. Phương pháp phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ
Phương pháp nhũ hóa bằng nhũ dầu khoáng kép Montanide ISA 201VG (nhũ nước trong dầu trong nước) của hãng Seppic (Pháp)
- Kháng nguyên và nhũ dầu được trộn theo tỷ lệ 1 : 1
- Quá trình nhũ hóa được thực hiện trên máy nhũ hóa vắc xin chuyên dụng với quy trình như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị pha dầu khoáng ISA 201VG đã tiệt trùng: khuấy nhẹ nhàng từ 50 - 100 vòng/phút trong khoảng 10 - 20 phút.
+ Bước 2: Chuẩn bị pha nước (kháng nguyên), chuyển từ từ kháng nguyên vào tank chứa pha dầu (theo tỷ lệ 1:1). Vừa chuyển kháng nguyên vừa tiếp tục khuấy trộn đến khi chuyển hết lượng kháng nguyên cần.
+ Bước 3. Tạo nhũ bằng máy khuấy chuyên dụng tại tốc độ 300 - 400 vòng/phút trong 20 - 30 phút. Quan sát thấy huyễn dịch đồng nhất hoàn toàn thì tắt máy khuấy.
Phương pháp phối trộn kháng nguyên với chất bổ trợ keo phèn nhôm Al(OH)3
- Kháng nguyên và chất bổ trợ được trộn theo tỷ lệ 1:1.
- Quá trình phối trộn được thực hiện trên tank phối trộn vắc xin chuyên dụng với quy trình như sau:
+ Bước 1: Chuẩn bị keo phèn phèn nhôm Al(OH)3 đã tiệt trùng: khuấy nhẹ nhàng từ 100 – 200 vòng/phút trong khoảng 20 - 30 phút.
+ Bước 2: Chuẩn bị kháng nguyên đã làm mát 2 - 8oC. Khuấy trộn 100 – 200 vòng/phút cho hỗn dịch đồng nhất.
+ Bước 3: Chuyển từ từ lượng keo phèn nhôm vào tank chứa kháng nguyên (theo tỷ lệ 1:1). Vừa chuyển keo phèn vừa tiếp tục khuấy trộn đến khi chuyển hết lượng keo phèn cần.
+ Bước 4: Tiếp tục khuấy trộn với tốc độ 100 - 200 vòng/phút trong 60 - 120 phút. Quan sát thấy huyễn dịch đồng nhất hoàn toàn thì tắt máy khuấy. Bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8oC.
3.5.3.3. Phương pháp kiểm tra sau khi nhũ hóa vắc xin
- Kiểm tra tính chất nhũ đơn, nhũ kép bằng phương pháp Drop test: Nhỏ 2 ml vắc xin vào cốc nước cất, lặp lại 3 lần. Quan sát sự khuyếch tán giọt dầu trong nước. Dầu khoáng kép: Một phần nổi lên trên bề mặt thành lớp màu trắng, phần khác phân tán trong nước.
- Kiểm tra độ ổn định của nhũ theo hướng dẫn của nhà sản xuất: Ly tâm 10ml vắc xin tại 3500 vòng/30 phút kiểm tra mức độ phân pha của mẫu vắc xin nhũ dầu theo chỉ tiêu yêu cầu của nhà cung cấp. Nếu phần dầu tách ra ở phía trên trong giới hạn 5-10% cho phép và có thể phục hồi bằng tay khi đó vắc xin được chấp nhận.
- Kiểm tra hạt nhũ: Làm tiêu bản vắc xin và soi dưới kính hiển vi độ phóng đại tối thiểu 400 lần, yêu cầu hạt nhũ có kích thước nhỏ và đều.
3.5.4. Phương pháp lựa chọn động vật thí nghiệm
- Động vật thí nghiệm: lựa chọn lợn khoẻ mạnh, từ 4 -5 tuần tuổi, chưa được tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM.
- Để xác định động vật chưa tiêm vắc xin LMLM hoặc có bị nhiễm tự nhiên hay không sử dụng phương pháp ELISA: Kit ELISA phát hiện kháng thể kháng protein phi cấu trúc từ hãng IDEXX: Foot and mouth disease (FMD) multispecies Antibody Test Kit code 06-41379-00.
- Các bước thực hiện:
Bước 1: Huyết thanh
Lấy lượng giếng phủ kháng nguyên tương đương với lượng mẫu cần kiểm tra ghi lại vị trí mẫu . Các giếng còn lại chưa sử dụng được bảo quản trong túi có zip chống ẩm bảo quản 2-80C.
Ủ mẫu trong thời gian ngắn:
Cho 90µl dung dịch pha loãng mẫu vào mỗi giếng. Cho10µl đối chứng dương (PC) vào hai giếng Cho10µl đối chứng âm (NC) vào hai giếng
Cho 10 µl vào các giếng chứa dung dịch pha loãng mẫu Sử dụng pipet đa kênh trộn đều 10 lần ở tất cả các giếng
Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18-260C trong 60 phút (cho phép dao động 5 phút)
Bước 2: Conjugate
Đĩa sau khi ủ 18 - 260C trong 60 phút với cách ủ thời gian ngắn và 18-260C trong 30 phút với cách ủ thời gian dài.
Gỡ tấm dán mặt đĩa loại bỏ dung dịch trong đĩa ủ.
Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa 1X 300 µl/giếng/lần. Tránh để quá khô giữa các lần rửa và các đĩa rửa. Lần cuối cùng của lần rửa đập nhẹ đĩa vào giấy thấm để loại bỏ hết dung dịch rửa trong giếng.
Cho 100µl conjugate vào mỗi giếng
Với quy trình ủ trong thời gian ngắn: Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18-260C trong 60 phút (dao động 5 phút).
Với quy trình ủ trong thời gian qua đêm: Dán tấm dán mặt đĩa và ủ ở 18- 260C trong 30 phút (dao động 5 phút).
Bước 3: Cơ chất
Đĩa sau khi ủ conjugate gỡ tấm dán mặt đĩa loại bỏ dung dịch trong đĩa Rửa đĩa 5 lần bằng dung dịch rửa 1X 300 µl/giếng/lần. Tránh để quá khô giữa các lần rửa và các đĩa rửa. Lần cuối cùng của lần rửa đập nhẹ đĩa vào giấy thấm để loại bỏ hết dung dịch rửa trong giếng.
Cho 100µl TMB vào mỗi giếng
Ủ ở 18-260C trong 10 phút (dao động 1 phút)
Bước 4: Dừng phản ứng và đọc kết quả
Cho 100µl stop solution vào mỗi giếng
Đọc kết quả bằng máy đọc ELISA bước sóng 450nm (Chú ý nên đọc kết quả trong vòng 2 giờ sau khi dừng phản ứng)
Bước 5: Tính kết quả
Đối chứng: Đối chứng âm (Negative control: NC) Đối chứng dương (Positive Control: PC)
NCx= PCx =
Giá trị hợp lệ khi:
NCx ≤0.3 PCx ≤2.0 PCx-NCx≥0.3
Trong trường hợp kết quả giá trị đối chứng âm và đối chứng dương không hợp lệ thì cần phải làm lại thí nghiệm.
Mẫu:
S/P % = 100 x Sample A(450)-NCx) (PCx-NCx) Kết luận:
Đối với trâu bò, dê, cừu: S/P % < 35 là âm tính, S/P % ≥ 35 là dương tính Đối với lợn: S/P % < 55 là âm tính, S/P % ≥ 55 là dương tính
3.5.5. Phương pháp xác định liều gây nhiễm và số lần tiêm vắc xin cho lợn
Bước 1: Xây dựng khung liều vi rút O/FMD/Avac3 trước khi vô hoạt: 106 , 107, 107,5 TCID50/ml
Bước 2: Tiến hành vô hoạt từng nồng độ vi rút. Phối trộn với chất bổ trợ nhũ dầu.
Chuẩn bị động vật thí nghiệm: 35 con lợn 4 -5 tuần tuổi, chưa được tiêm vắc xin LMLM và không có kháng thể LMLM
Bố trí thí nghiệm như sau:
Nhóm Kí hiệu nhóm (2ml/con/lần)Số lần tiêm Số con
106 (TCID50/ml) N1 1 5 N2 2 5 107 (TCID50/ml) N3 1 5 N4 2 5 107,5 (TCID50/ml) N5 1 5 N6 2 5
Đối chứng N7 Không tiêm 5
Lợn được tiêm 2 mũi, mũi 2 cách mũi 1 là 28 ngày
Lấy máu thu hoạch huyết thanh vào các thời điểm 0, 14, 21, 28, 35, 42, 49