Loài hải miên Rhabdastrellaglobostellata (Carter, 1883)

Một phần của tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos ở Việt Nam. (Trang 40)

Mẫu hải miên R. globostella (Carter, 1883) được thu ở vịnh Vân Phong, Nha Trang vào tháng 5 năm 2020. Tên khoa học của mẫu được xác định bằng phương pháp sinh học phân tử bởi TS. Trần Mỹ Linh, phòng Tài nguyên sinh vật, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam (VAST). Mẫu tiêu bản (NCCT-B139) được lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, VAST.

Hình 2.1. Hình ảnh mẫu hải miên R. globostellata thu tại vịnh Vân Phong 2.1.2. Loài hải miên Aaptos aaptos (Schmidt, 1864)

Mẫu hải miên A. aaptos (Schmidt, 1864) được thu ở vịnh Vân Phong, Nha Trang vào tháng 5 năm 2020. Tên khoa học của mẫu được xác định bởi GS.TS. Đỗ Công Thung, Viện Tài nguyên và Môi trường biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công Nghệ Việt Nam (VAST). Mẫu tiêu bản (NCCT-70) được lưu giữ tại Viện Hóa sinh biển, VAST.

2.2. Phương pháp nghiên cứu

2.2.1. Phương pháp phân lập các hợp chất

- Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254S (Merck). Phát hiện chất bằng thuốc thử Dragendorff hay bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng từ từ đến khi hiện màu.

- Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel và pha đảo RP-18. Silica gel có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh). Pha đảo RP-18 (150 µm, Fuji Silysia Chemical Ltd.). Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Mitsubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).

- Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao bán điều chế (HPLC) được thực hiện trên máy

AGILENT 1100, phòng Nghiên cứu cấu trúc, viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH và CN VN. Tốc độ dòng 3ml/phút, sử dụng 4 bước sóng 205, 230, 254 và 280 nm để phát hiện chất.

2.2.2. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất

Phương pháp chung để xác định cấu trúc hoá học của các hợp chất là sự kết hợp xác định giữa các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại bao gồm:

- Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS

Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy AGILENT 6530 Accurate Mass QTOF LC/MS của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Phổ NMR đo trên máy: Bruker AM500 FT-NMR của Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Chất nội chuẩn là TMS (Tetrametyl Silan).

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

+ Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1H-NMR, 13C NMR và DEPT. + Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và NOESY.

+ Dung môi được sử dụng bao gồm các dung môi CD3OD, CDCl3 và DMSO_d6. Việc lựa chọn dung môi đo phụ thuộc vào bản chất của từng mẫu, trên nguyên tắc là dung môi phải hòa tan hoàn toàn mẫu đo và không che khuất các tín hiệu phân tích.

- Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

Phổ CD được đo trên máy ChirascanTM CD spectrometer (Applied Photophysics Ltd., Surrey, UK) tại Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam.

-Phương pháp tính toán lý thuyết phổ ECD

Tìm kiếm cấu dạng được thực hiện trên phần mềm Spartan 18 (Viện Hóa sinh biển). Mỗi phân tử được thực hiện theo phương pháp cơ học lượng tử MMFF (Merck molecular force field) và bán lượng tử PM3. Các cấu dạng nhận được có hệ số phân bố Boltzmann trên 1% sẽ được tối ưu hóa và tính toán phổ ECD theo hàm mật độ phụ thuộc thời gian (Time Dependent Density Functional Theory, TDDFT) trên phần mềm Gaussian 16 (Viện Hóa sinh biển) sử dụng các mức tính toán B3LYP/6- 31G(d,p), CAM-B3LYP/6-31G(d,p), hoặc wB97XD/6-31G(d,p). Ảnh hưởng của dung môi methanol được tính toán theo mô hình IEFPCM (Integral Eequation Formalism Polarizable Continuum Model). Các phổ ECD thu được của mỗi cấu dạng sẽ được tổng hợp lại dựa trên hệ số phân bố Boltzmann của chúng sử dụng mềm SpecDis v1.71 để nhận phổ ECD theo lý thuyết của mỗi hợp chất.

- Phương pháp tính toán khoảng cách giữa hai proton

Các cấu dạng được tìm kiếm trên phần mềm Spartan 18. Các cấu dạng nhận được có hệ số phân bố Boltzmann trên 1% sẽ được tối ưu hóa năng lượng và tính toán khoảng cách giữa các proton trên phần mềm Gaussian 16.

- Phương pháp tính toán lý thuyết 13C-NMR

Tìm kiếm cấu dạng được thực hiện trên phần mềm Spartan 18. Các cấu dạng nhận được có hệ số phân bố Boltzmann trên 1% sẽ được tối ưu hóa và tính toán NMR

bằng phương pháp GIAO 13C NMR sử dụng phần mềm Gaussian 16 với mức tính

toán wB97XD/6-31G(d). Các số liệu NMR thu được của mỗi cấu dạng sẽ được tổng hợp lại dựa trên hệ số phân bố Boltzmann của chúng để nhận được số liệu NMR tính toán cho mỗi hợp chất. Cuối cùng, dữ liệu NMR tính toán sẽ được so sánh với dữ liệu NMR thực nghiệm bằng mô hình tính toán STS (Sorted Training Sets) [50].

Độ quay cực được đo trên máy JASCO P-2000 Polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.2.3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

Phương pháp đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư

Hoạt tính gây độc dòng tế bào ung thư được thử nghiệm trên 4 dòng tế bào ung thư ở người bao gồm ung thư gan (HepG2), ung thư phổi (LU-1), ung thư vú (MCF7) và ung thư da (SKMel2) tại Phòng Thử nghiệm sinh học – Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm KH và CN Việt Nam. Phương pháp thử độ độc tế bào in

vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute – NCI) xác

nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Skekan [51](1990). Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (OD – Optical Density) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

+ Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm.

+ Chất thử đã pha ở các nồng độ được đưa vào các giếng của đĩa 96 giếng. Giếng không có chất thử nhưng có TBUT (190 µL) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0 tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid – TCA 20%.

+ Ủ trong tủ ấm 72 giờ. Sau 72 giờ, tế bào được cố định bằng TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 oC, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi để khô ở nhiệt độ phòng.

+ 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ trong 10 phút rồi đọc kết quả OD ở bước sóng 540 nm trên máy ELISA Plate Reader (Biotek).

+ Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:

- Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồng độ 10

µg/ml; 2 µg/ml; 0,4 µg/ml; 0,08 µg/ml được sử dụng như là chất đối chứng dương; - DMSO 1% luôn được sử dụng như đối chứng âm.

- Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50% sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

- Các dòng tế bào do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Long-Island, US và GS. Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp.

2.3. Phân lập các hợp chất

2.3.1. Phân lập các hợp chất từ loài hải miên R. globostellata

Mẫu hải miên R. globostellata (40 kg) được rửa sạch để loại bỏ muối, ngâm chiết siêu âm với MeOH (3 lần 50 lít, mỗi lần 2h), sau khi thu được dịch chiết cất loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được 420 g cặn MeOH. Sau đó, cặn này được bổ sung thêm 3 lít nước và chiết phân lớp bằng dung môi dichloromethane (2 lần3 lít), dịch chiết dichloromethane được cất quay để loại bỏ dung môi thu được cặn chiết dichloromethane (320,0 g) và dịch nước.

Cặn chiết dichloromethane được phân tách trên cột silica gel, rửa giải gradient bằng hệ dung môi độ phân cực tăng dần dichloromethane/methanol (1:0 → 0:1, v/v) thu được bốn phân đoạn nhỏ hơn RD1 (20,0 g), RD2 (200,0 g), RD3 (60,0 g) và RD4 (35,0 g). Phân đoạn RD2 tiếp tục được phân tách trên cột silica gel, rửa giải gradient bằng hệ dung môi n-hexan/acetone (0-100%, tăng dần acetone) thu được 4 phân đoạn RD2A-RD2D. Phân đoạn RD2B được phân tách bằng cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi acetone/nước (2/1, v/v) thu được 5 phân đoạn, RD2B1–RD2B5. Sau đó, phân đoạn RD2B2 được tinh chế trên cột HPLC điều chế (J’sphere ODS H- 80, 250mm×20mm) với hệ dung môi rửa giải là 30 % ACN trong nước thu được hợp chất RG11 (7,3 mg, tR = 22,4 phút). Hợp chất RG6 (15.2 mg, tR = 42,3 phút) thu được từ phân đoạn RD2B4 bằng điều kiện tương tự phân đoạn RD2B2. Tiếp theo, phân đoạn RD2C được đưa lên cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi

acetone/nước (1,5/1, v/v) thu được 2 phân đoạn RD2C1-RD2C2. Phân đoạn RD2C1 được tinh chế trên cột HPLC điều chế (J’sphere ODS H-80, 250mm×20mm) với hện dung môi 65% ACN thu được hợp chất RG1 (5,9 mg, tR = 38,0 phút) và RG2 (17,5 mg, tR = 48,7 phút). Hai hợp chất RG3 (5,2 mg, tR = 34,0 phút) và RG7 (6,2 mg, tR = 58,8 phút) được điều chế từ phân đoạn RGD2C2 bằng cột HPLC với dung môi 60% ACN. Phân đoạn RD3 (60,0 g) được phân tách bằng cột pha đảo RP-18 với hệ dung môi methanol/nước (3/1, v/v) thu được bốn phân đoạn nhỏ hơn, RD3A- RD3D. Phân đoạn RD3A tiếp tục được đưa lên cột silica gel pha thường với dung môi rửa giải n-hexan/acetone (3/1, v/v) thu được ba phân đoạn RD3A-RD3A3. Hợp chất RG12 (5,2 mg, tR = 53,3 phút) thu được từ phân đoạn RD3A3 điều chế trên cột HPLC trong điều kiện 22% ACN trong nước. Phân đoạn RD3C được đưa lên cột sắc kí silica gel pha thường điều kiện n-hexan/ethyl acetate (2/1, v/v) thu được 5 phân đoạn RD3C-RD3C4. Phân đoạn RD3C1 tiếp tục được tinh chế trên cột HPLC với 70% ACN thu được hai hợp chất RG10 (5,4 mg, tR = 48,5 phút) và RG8 (5,8 mg, tR = 50,0 phút). Phân đoạn RD3C2 cũng được đưa lên cột HPLC nhưng khác hệ dung môi, ACN-H2O (95-15, v/v) thu được hợp chất RG9 (5,7 mg, tR = 51,5 phút). Hợp chấ RG4 (10,0 mg, tR = 59,14 phút) thu được từ phân đoạn RD3C3, nhưng hệ dung môi rửa giải là ACN-H2O (85-15, v/v). Cuối cùng, phân đoạn RD3C4 được đưa lên cột HPLC để tinh chế với hệ dung môi rửa giải là 70% ACN thu được hợp chất RG5 (19,5 mg, tR = 43,7 phút).

RD2 (200 g)

Gradient 100% D

RD1 ( 20 g)

D/M : 1/0-0/1 Gradient Silica gel c.c

(5.9 mg) (17.5 mg) (5.2 mg)RG1RG2RG3 85 % ACN 70 % ACNHPLC RD3C 3HPLC RD3C4 32

Hình 2.3. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài hải miên R. globostellata

RD3C2

HPLC

RD3C1

HPLC 65% ACN

RD3A1 RD3A2 RD3A3 RD2C2 HPLC RD2B5 RD2C1 HPLC RD2B4 HPLC D2B1 RD2B2 RD2B3 HPLC 30% ACN 100% M RD4 (35.0 g) D/M: 20/1 RD3 (60 g) RP-18 M:W 3:1 Silica gel c.c H/A :1/0-0/1 D/M: 40/1 Lớp nước Cặn CH2Cl2 (320.0 g)

Rhabdastrella globostellata(40 kg tươi)

Chiết với methanol (3 lần × 50 L, 2h) Sau đó cất loại bỏ dung môi

Methanol ext. (420 g )

Bổ sung nước và chiết phân lớp với dung môi dichloromethane, sau đó cất quay loại dung môi

HPLC: High Performance Liquid Chromatography H: n-hexan M: Methanol W: Nước ACN: Acetonitrile A: Acetone c.c: Column chromatography D: Dichloromethane EtOAc: Ethyl acetate

100% H RD2A H/A: 10/1 RD2B RP-18 c. c. A/W: 2/1 H/A: 5/1 RD2C RP-18 c. c. A/W: 1.5/1 100% A RD2D RD3A Silica gel c. c. H/A: 3/1 RD3B RD3C Silica gel c. c. H/E: 2/1 RD3D RG11 (7.3 mg) tR 22.4 RG6 (15.2 mg) tR 42.3 RG12 RG10 RG5 (19.5 mg) tR 43.7 RG4 (10.0 mg) tR 59.4 RG8 RG9 (5.8 mg) (5.7 mg) tR 50.0 tR 51.5 tR 48.5 tR 53.3 tR 34.0 tR 48.7 tR 38.0 (5.2 mg) (5.4 mg) RG7 (6.2 mg) tR 58.8 70 % ACN 95 % ACN 60% ACN HPLC 22% ACN 30% ACN

33

2.3.2. Phân lập các hợp chất từ loài hải miên A. aaptos

Mẫu hải miên A. aaptos (30 kg) được rửa sạch để loại bỏ muối, ngâm chiết siêu âm với MeOH (3 lần  50 lít, mỗi lần 2h), sau khi thu được dịch chiết cất loại bỏ dung môi ở áp suất giảm thu được 490g cặn MeOH. Cặn dịch này được bổ sung thêm 2 lít nước và chiết phân lớp bằng dung môi dichloromethane (2 lần2 lít), dịch chiết này được cất quay để loại bỏ dung môi thu được cặn chiết AD (215,0 g) và dịch nước.

Cặn chiết dichloromethane AD được phân tách trên cột silica gel, rửa giải gradient bằng hệ dung môi dichloromethane/methanol với độ phân cực tăng dần (dichloromethane/methanol: 1/0→ 0/1, v/v) thu được 7 phân đoạn AD1-AD7. Phân đoạn AD2 (15,3 g) được đưa lên cột silica gel pha đảo RP-18 với hệ dung môi rửa giải methanol/nước (1,5/1, v/v) thu được 4 phân đoạn AD2A - AD2D. Phân đoạn AD2B (1,79 g) được đưa lên cột pha thường với hệ dung môi rửa giải dichloromethane/acetone (8/1, v/v) để tinh chế, thu được hợp chất AA6 (18,2 mg). Tiếp tục đưa phân đoạn AD2C (1,55 g) lên cột pha thường với hệ dung môi rửa giải ethylacetate/methanol/nước (9/1/0,1, v/v/v) thu được hợp chất AA2 (13,9 mg) và hợp chất AA7 (20,6 mg). Phân đoạn AD5 (21,3 g) được tách trên cột silica gel với hệ dung môi rửa giải hexane/ethyl acetate (3/1, v/v) thu được 5 phân đoạn nhỏ hơn AD5A-AD5E. Hợp chất AA3 (9,0 mg) và AA8 (22,1 mg) thu được từ phân đoạn AA5A (3,4 g) sử dụng sắc ký cột pha thường, hệ dung môi rửa giải dichloromethane/methanol (10/1, v/v). Tiếp tục tinh chế phân đoạn AD5C (2,5 g) trên cột pha thường với dichloromethane/acetone (2/1, v/v) là dung môi rửa giải, thu được hợp chất AA4 (5,3 mg). Phân đoạn AD5D (1,1 g) tiếp tục được tiến hành sắc ký cột pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexane/ethyl acetate (2/1, v/v) thu được 3 phân đoạn AD5D1-AD5D3. Phân đoạn AD5D3 có lượng chất nhỏ (100 mg) nên được đưa lên cột HPLC (ODS H-80, 250mm×20mm), với hệ dung môi rửa giải là 15% ACN, thu được hợp chất AA9 (9,8 mg). Cuối cùng, phân đoạn AD5E (1,5 g) được sắc kí trên cột YMC với hệ dung môi rửa giải acetone/nước (1/1, v/v), sau đó tiếp tục tinh chế các phân đoạn này bằng cột pha thường với dung môi rửa giải dichloromethane/ethyl acetate (2/1, v/v) thu được hợp chất AA1 (6,4 mg) và AA5 (9,6 mg).

34

A: Acetone H: n-hexan c.c: Column chromatography M: Methanol D: Dichloromethane W: Nước EtOAc: Ethyl acetate ACN: Acetonitrile HPLC: High Performance Liquid Chromatography

Aaptos aaptos (30 kg tươi)

Chiết với methanol (3 lần × 50 L) Sau đó quay cất thu hồi dung môi

Methanol ext. (490.0 g )

Bổ sung nước và chiết phân lớp với dung môi dichloromethane, Sau đó quay cất thu hồi dung môi

Cặn CH2Cl2 (215.0 g)

Lớp nước

Gradient Silica gel c. c. D/M: 1/0→0/1

AD1 (39.0 g) AD2 (15.3 g) AD3 (18.1 g) AD4 (11.3 g) AD5 (21.3 g) AD6 (74.4 g) AD7 (35.6g)

RP-18 c. c. M/W: 1.5/1

Silica gel c. c. H/E: 3/1

AD2A (1.5 g) AD2B (1.79 g) AD2C (1.55 g) AD2D (1.34 g) AD5A (3.4 g) AD5B (4.5 g) AD5C (2.5 g) AD5D (1.1 g)

Silica gel c. c

AD5E (1.5 g)

RP-18 c. c. Silica gel c. c.

D/A: 8/1 Silica gel c. c. E/M/W: 9/1/0.1

Silica gel c. c.

D/M: 10/1 Silica gel c. c. D/A: 2/1

H/E: 2/1 A/W: 1/1

AD5D1 AD5D2 AD5D3

(100 mg) AD5E1 (16 mg) AD5E2 (125 mg) 15 % ACN Silica gel c. c. D/E 2:1 Silica gel c. c. D/E 2:1 AA5 (9.6 mg)

AA6 AA2 AA7 AA3 AA8 AA4 AA9 AA1

2.4. Thông số vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất phân lập được

2.4.1. Thông số vật lý của các hợp chất phân lập từ loài hải miên R. globostellata

2.4.1.1. Hợp chất RG1: rhabdaglostelone A (hợp chất mới)

Chất dạng gel màu vàng,

Độ quay cực [α ]25 : +58,4 (c 0,1, MeOH) Công thức phân tử: C30H38O5 Khối lượng phân tử: 478

Phổ (+)-HR-ESI-MS m/z: 479,2795 [M+H]+

Tính toán lý thuyết cho công thức C30H39O5: 479,2797 Phổ (-)-HR-ESI-MS m/z: 477,2644 [M-H]-

Tính toán lý thuyết cho công thức C30H37O5: 477,2641 ECD (MeOH) θ (λ nm): −51,2 (252), +13,6 (304-326) mdeg

Số liệu phổ 1H NMR (500 MHz) và 13C NMR (125 MHz) xem ở Bảng 3.1.

2.4.1.2. Hợp chất RG2: rhabdaglostelone B (hợp chất mới)

Chất dạng gel màu vàng.

Độ quay cực [α ]25 : −39,7 (c 0,1,

MeOH) Công thức phân tử: C30H38O5 Khối lượng phân tử: 478

Phổ (+)-HR-ESI-MS m/z: 479,2791 [M+H]+

Tính toán lý thuyết cho công thức C30H39O5: 479,2797 Phổ (-)-HR-ESI-MS m/z: 477,2641 [M-H]-

Tính toán lý thuyết cho công thức C30H37O5: 477,2641

ECD (MeOH) θ (λ nm): −19,2 (255), +5,73 (298), −10,6 (342) mdeg Số liệu phổ 1H NMR (500 MHz) và 13C NMR (125 MHz) xem ở Bảng 3.3

2.4.1.3. Hợp chất RG3: rhabdaglostelone C (hợp chất mới)

Chất dạng gel màu vàng.

Độ quay cực [α ]25 : -22,5 (c 0,1, MeOH) Công thức phân tử: C29H38O5 Khối lượng phân tử: 466

Phổ (+)-HR-ESI-MS m/z 467,2797 [M+H]+

Tính toán lý thuyết cho công thức C29H39O5: 467,2797 Phổ (-)-HR-ESI-MS m/z 501,2419 [M+Cl]-

Tính toán lý thuyết cho công thức C29H38O5Cl: 501,2408

Số liệu phổ 1H NMR (500 MHz) và 13C NMR (125 MHz) xem ở Bảng 3.5

D

D

D

2.4.1.4. Hợp chất RG4: rhabdastrenone A (hợp chất mới)

Chất dạng sáp không màu.

Một phần của tài liệu Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của hai loài hải miên Rhabdastrella globostellata và Aaptos aaptos ở Việt Nam. (Trang 40)

Tải bản đầy đủ (DOCX)

(160 trang)
w