- Phân tích thông tin về trình tự và biểu hiện gen Galactinol synthase: Dựa trên các nghiên cứu trước đây kết hợp với nguồn dữ liệu mở trên NCBI, Phytozome và SoyKB, trình tự hai gen mã hóa cho enzyme galactinol synthase có mức độ biểu hiện cao trên hạt đậu tương đã được xác định Sử dụng chương trình tin sinh học (CRISPR- PLANT) và (CRISPR Design Tool), kết hợp với trình tự gen đã được lựa chọn để xác định trình tự định hướng (sgRNAs) theo phương pháp của Vibha Srivastava và cộng sự (2017) [86] Từ 2-3 trình tự định hướng tối ưu với độ tương đồng cao về trình tự ở trên hai gen quan tâm sẽ được thiết kế Khung vector chuyển gen thực vật chứa gen
Cas9 nhận được từ nguồn Addgene
Galactinol synthase và promoter U6 (Arabidopsis U6 promoter) được kết nối sử dụng hệ thống cloning vector (NEB® Golden Gate Assembly Kit -BsaI-HF®v2)
- Các cấu trúc mang trình tự định hướng và promoter U6 được ghép nối vào vector chuyển gen pFGC-Cas9 sử dụng hệ thống pFGC-Cas9-gateway được cung cấp bởi phòng thí nghiệm của giáo sư Stacey, đại học Missouri, Mỹ [87] Cụ thể như sau:
Bước 1: Ghép nối phân đoạn gen biểu hiện Cas9 (35S promoter-Cas9-Nos terminator) từ vector HBT-proCas9 sang vector đích pFGC5941 (-) thông qua các phản ứng cắt và nối ghép gen tại vị trí các enzyme cắt hạn chế XhoI và EcoRI, tạo thành vector pFGC5941(-)/Cas9
Bước 2: PCR khuếch đại các phân đoạn phiên mã các gRNAs bao gồm: PstI/U6 promoter-gRNA1-gRNA scaffold/EcoRI và EcoRI/U6 promoter-gRNA2-gRNA scaffold/PstI bằng phản ứng overlap PCR sử dụng khuôn là vector pBlu-gRNA và các cặp mồi như đã nêu trong bảng phụ lục 1
Bước 3: Nối ghép đồng thời 2 phân đoạn phiên mã 2 gRNA vào
vector pFGC5941(-)/Cas9 tạo thành vector hoàn chỉnh pFGC5941(-) /Cas9/gRNA1/gRNA2
+ Xử lý vector pFGC5941(-)/Cas9 bằng PstI
+ Xử lý đồng thời 2 phân đoạn PstI/U6 promoter-gRNA1-gRNA scaffold/EcoRI và EcoRI/U6 promoter-gRNA2-gRNA scaffold/PstI bằng cặp
enzyme hạn chế PstI và EcoRI
+ Tiến hành phản ứng ligation dưới xúc tác của enzyme T4-DNA ligase nối ghép đồng thời vector pFGC5941(-)/Cas9 đã được mở vòng và 2 phân đoạn
gRNA đã xử lý enzyme cắt hạn chế
Sơ đồ thiết kế của vector chuyển gen hoàn chỉnh được mô phỏng như Hình 3 4 - Vector chỉnh sửa gen sau khi được hoàn thiện sẽ được chuyển vào chủng vi khuẩn A rhizogenes và A tumefaciens AGL1 do phòng Công nghệ tế bào thực vật cung cấp bằng phương pháp sốc nhiệt của David Neece (2013)
2 3 2 Cảm ứng rễ tơ thông qua vi khuẩn A rhizogenes
Hệ thống rễ tơ được phát triển trong điều kiện in vitro nhằm tối ưu quy trình cảm ứng tạo rễ tơ trên đậu tương phục vụ cho mục đích kiểm tra hoạt động của cấu trúc chuyển gen và hiệu quả chỉnh sửa hệ gen thông qua hệ thống CRISPR/Cas9
Bảng 2 1 Thành phần các loại môi trường trong nuôi cấy tạo rễ tơ in vitro đậu tương
Quy trình chuyển gen tạo rễ tơ theo phương pháp nốt lá mầm được xây dựng trên cơ sở nghiên cứu của Chen và cộng sự (2018) [81] có cải biến với thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở Bảng 2 1
- Chuẩn bị nguyên liệu biến nạp
Hạt đậu tương được chọn dùng làm nguyên liệu biến nạp là những hạt to, tròn đều, vỏ hạt đồng màu, nhẵn, không bị tổn thương; được đặt trong đĩa petri riêng cho từng giống Các đĩa hạt được mở và đặt trong bình hút ẩm bằng thủy tinh trong tủ hút an toàn sinh học để được khử trùng bằng khí Clo (tạo thành từ 100 ml NaOCl 10% và 4 ml HCl 12N), đóng nhanh nắp bình và niêm phong bằng parafilm ngay sau đó Hạt giống được khử trùng trong thời gian từ 18-20 giờ tùy theo giống để đảm bảo độ nảy mầm cho hạt
Đĩa hạt sau khi khử trùng sẽ được đóng nắp và chuyển vào tủ cấy vô trùng Hạt được gieo với số lượng 5 hạt cho 1 đĩa chứa 20 ml môi trường GCM, điều kiện nuôi cấy 26-28ºC, thời gian chiếu sáng 8 giờ/ngày Lá mầm được tách từ cây mầm 3 ngày tuổi sẽ được dùng nguyên liệu cho quá trình biến nạp
- Biến nạp nuôi cấy tạo rễ tơ
Chuẩn bị khuẩn và môi trường lây nhiễm: khuẩn A rhizogenes gốc lưu trữ trong glycerol 25%, ở -80ºC được cấy trên môi trường tạo khuẩn lạc trong 2-3 ngày ở điều kiện tối, nhiệt độ 28ºC Tiếp theo, các khuẩn lạc đơn được nuôi cấy trên môi trường nuôi cấy huyền phù vi khuẩn trong điều kiện lắc 250 vòng/phút, nhiệt độ 28ºC, qua đêm Dịch nuôi khuẩn được ly tâm, thu sinh khối và hòa loãng về mật độ vi khuẩn OD660 đạt mức 0,6 trong môi trường lây nhiễm để tạo huyền phù vi khuẩn dùng cho biến nạp
Tên môi trường Thành phần
Gieo hạt (GCM) MS (Murashige and Skoog, 1962); 20 g/l sucrose; 3g/l phytagel, pH 5,6
Nuôi cấy khuẩn lạc YEP (Yeast Extract Peptone); 12 g/l Bacto agar; khángsinh (streptomycine, spectinomycine và kanamycine nồng độ (500 mg/l) tùy thời điểm, pH 7,0
Lây nhiễm ½ MS; 20 g/l sucrose, pH 5,6 Nuôi cấy phát sinh rễ
tơ (ICM)
MS; 30 g/l sucrose; 3,0 g/l phytagel; kháng sinh cefotaxime nồng độ (500 mg/l), pH 5,6
Chọn lọc rễ tơ MS; 30 g/l sucrose; 3,0 g/l phytagel; kháng sinh
Lây nhiễm: sau 3 ngày gieo hạt, thân mầm và cuống lá được loại bỏ Lá mầm được tách ra và gây tổn thương bằng dao cấy tại vị trí nốt lá mầm để làm nguyên liệu chuyển nạp Tiếp đến, mẫu được ngâm trong huyền phù vi khuẩn khuẩn thời gian 30 phút Sau lây nhiễm, mẫu được đồng nuôi cấy trên bề mặt giấy thấm ẩm trong đĩa petri 5 ngày trong điều kiện sáng hoàn toàn ở 24-26ºC
Cảm ứng tạo rễ tơ: mảnh lá mầm sau khi đồng nuôi cấy sẽ được rửa khuẩn bằng dung dịch nước cất bổ sung cefotaxime nồng độ 500 mg/l và chuyển lên môi trường ICM cảm ứng tạo rễ tơ trong 5 ngày, điều kiện 26ºC, sáng hoàn toàn Rễ tơ đậu tương có chiều dài từ 1,5-2 cm được cấy chuyển trên môi trường chọn lọc rễ tơ có chứa glufosinate 3,0 mg/l Hệ rễ phát triển trên môi trường chọn lọc được thu thập và sử dụng cho đánh giá biểu hiện của gen chuyển cũng như các phân tích khác
2 3 3 Kiể m tra s ự có m ặt và bi ể u hi ệ n c ủ a gen ch ỉ thị và gen ch ọn l ọc trong r ễ tơđậu tương đậu tương
Đối với hệ rễ tơ hình thành từ cấu trúc mang gen chỉ thị gus sẽ được ngâm trong dung dịch X- Gluc và đặ t trong tủ ổn nhi ệt 37ºC qua đêm theo phương pháp củ a Jefferson và đồ ng tác gi ả [88] Biểu hiện màu GUS (xanh lam) được quan sát, thống
kê và ch ụp ảnh lưu giữ Biể u hi ệ n c ủa gen gfp được ki ể m tra b ằ ng cách soi tr ự c ti ế p bằ ng kính hiể n vi hu ỳnh quang (Oplympus- U-SPT (Japan-SZ X 12) ), đoạ n r ễ tơ chứ a c ấ u trúc chuyể n gen s ẽ phát sáng, độ phát sáng tùy thu ộc vào bi ể u hi ệ n c ủa gen gfp
Các dòng r ễ tơ in vitro được tách chi ế t DNA genome theo phương pháp CTAB c ủ a Doyle và cộ ng sự (1991)
Cặp mồi đặc hiệu Bar-F (5’-TACCATGAGCCCAGAACGACGCCC-3’); Bar-R (5’-TACCATGAGCCCAGAACGACGCCC- 3’) được s ử d ụng ki ể m tra sự có
mặt của gen chọn lọc bar và cặp mồi Cas9-F (5’-
GCCCAAGAGGAACAGCGATAAGC-3’); Cas9-R (5’-CAGTTCGCCGGCA GAGGCCAGC- 3’) được sử dụng để kiể m tra s ự có mặ t c ủa gen mã hóa protein Cas9 trong c ấ u trúc chuyể n gen có trong r ễ tơ in vitro
Sản phẩm PCR được được kiểm tra và phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%
2 3 4 Xác định và phân tích đột bi ến định hướng trên các gen đích củ a các dòngrễ tơ đậu tương rễ tơ đậu tương
gen GmGOLS03: G03F/R (5’-TGACGGAAATGGCCATGCTCCTG-3’/5’- CCCCGTATATCTCCATGGCTTGG-3’) và gen GmGOLS 19: G19F/R(5’-
TCTTGATTGAGTAAGGTGTGAG-3’/5’-GCGCCAGAGCATGGCAAGGAC- 3’) Sả n ph ẩ m khu ếch đại được điệ n di trên gel agarose 1% ho ặ c sử dụng cho phân tích bi ế n tính h ồ i tính trên gel polyacrylamide 15% theo phương pháp của Zhou và c ộng sự (2014) [89] C ụ thể , các mồi đặc hiệu cho gen GmGOLS03 hoặc GmGOLS19
sẽ được dùng để khuếch đại các dòng có thể mang đột biến và dòng không mang đột biến (WT) Thông qua phương pháp biến tính hồi tính hỗn hợp sản phẩm PCR của các dòng đột biến và WT, các DNA sợi đơn của dòng đột biến và WT sẽ sự kết hợp như Hình 2 2 A, kết quả xuất hiện băng vạch khi điện di trên gel polyacrylamide 15% (Hình 2 2 B)
Phương thức tiến hành như sau: (1) PCR độc lập các mẫu mẫu DNA của dòng đậu tương mang gen đột biến và dòng không mang đột biến (WT) (2) Trộn sản phẩm PCR của WT với mỗi dòng đột biến tỉ lệ 1:1 (3) Biến tính hỗn hợp nhiệt độ 950C trong 5 phút, sau đó hạ nhiệt độ về nhiệt độ phòng (4) Phân tích sản phẩm trên gel polyacrylamide 15%
Hình 2 1 Sơ đồ minh họa nguyên lý kỹ thuật biến tính hồi tính dùng trong sàng lọc
đột biến gen
A Minh hoạ các sự bắt cặp của các sợi đơn DNA của dòng đột biến và WT khi xử lý biến tính và hồi tính nhiệt; B Minh họa sản phẩm biến tính và hồi tính trên bản gel
polyacrylamide 15%, vạch màu thể hiện các điểm đột biến trên DNA
Sản phẩm PCR gen đích của các dòng rễ tơ tiếp tục được tinh sạch và chuyển sang vector nhân bản pJET1 2 (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) để giải trình tự bằng hệ thống ABI PRISM® 3100 Avant Genetic Analyzer với bộ giải trình tự
chu trình Applied Biosystems Big Dye Terminator (Ứng dụng Biosytems, Foster City, CA, USA) tại Viện Công nghệ Sinh học, Hà Nội, Việt Nam
2 3 5 Chuyển gen tạo cây đậu tương mang cấu trúc CRISPR/Cas9
Phương pháp chuyển gen vào cây đậu tương thông qua vi khuẩn A tumefaciens
được thực hiện dựa trên quy trình chuẩn tại phòng Công nghệ tế bào thực vật Viện Công nghệ sinh học (2020) [90] với các môi trường sử dụng trong thí nghiệm (Bảng 2 2) và bước thực hiện cơ bản như sau:
Bảng 2 2 Thành phần các môi trường sử dụng trong chuyển gen cây đậu tương
Tên môi trường
Thành phần pH
GCM (gieo hạt)
Muối đa lượng MS (10X) 100ml + muối vi lượng MS (100X) 10ml + Fe-NaEDTA (100X) 10ml + sucrose 20g/l + Agar 7 g/l
5,6
YEP lỏng (nuôi huyền phù khuẩn)
L-triptone or peptone 10g/l + Yeast Extract 10g/l + NaCl 5g/l (Nếu là môi trường đặc bổ sung Bacto agar 12 g/l)
7,0 - CCM lỏng (hòa khuẩn dùng biến nạp) - CCM đặc (đồng nuôi cấy)
Muối đa lượng B5 (10X) 10ml + Muối vi lượng B5 (100X) 1ml + Fe-NaEDTA (100X) 1ml + MES (20Mm) 3,9 g/l + sucrose 30g/l + Acetosyringone 0,04g/l + Viatmin B5 (100X) 10ml + GA3 (1mg/ml) 0,25ml + BAP (1,7mg/ml) 1ml + L-cystein 0,4g/l + Dithiothreitol (DTT) 0,154g/l + Na2SiO3 0,158g/l
(Nếu là môi trường đặc bổ sung Agar 5g/l)
5,4
- SIM lỏng (diệt khuẩn) - SIM đặc (tạo đa chồi)
Muối đa lượng B5 (10X) 100ml + muối vi lượng B5 (100X) 10ml + Fe-NaEDTA (100X) 10ml + MES (3 Mm) 0,6g/l + sucrose 30g/l + Viatmin B5 (100X) 10ml + BAP (1,7mg/ml) 1ml + Timetin 50mg/l + Glufosinate 5mg/l
(Nếu là môi trường đặc bổ sung Phytagel 3g/l)
5,7
SEM (môi trường kéo dài chồi)
Muối đa lượng B5 (10X) 100ml + muối vi lượng B5 (100X) 10ml + Fe-NaEDTA (100X) 10ml + MES (3 Mm) 0,6g/l + sucrose 30g/l + Viatmin B5 (100X) 10ml + GA3 (1mg/ml) 0,5ml + Timetin 50mg/l + Cefotaxime 100 mg/l + IAA
(1mg/ml) 100 microlit + Zeatin-R (1mg/ml) 1ml + Glufosinate 2 mg/l
RM (tạo rễ) Muối đa lượng MS (10X) 100ml + muối vi lượng MS (100X) 10ml + Fe-NaEDTA (100X) 10ml + MES (3 Mm) 0,6g/l + sucrose 20g/l + Viatmin B5 (100X) 10ml + BAP (1,7 mg/ml) 1ml + Timetin 50 mg/l + Asp/Glu (stock 5 mg/ml) 10ml + Cefotaxime 100 mg/l + Vancomycin 50 mg/l + Phytagel 3g/l
- Tạo nguyên liệu chuyển gen: hạt đậu tương chín sau khi được khử trùng, nảy mầm 3 ngày trên môi trường GCM, tách, thu phần lá mầm (tương tự như tạo nguyên liệu nuôi cấy rễ tơ in vitro ) và gây tổn thương bằng mũi dao nhọn từ 7 - 8 lần vào phần nốt lá mầm Lá mầm đã được làm tổn thương sẽ dùng cho bước nhiễm khuẩn tiếp theo
- Tạo dịch huyền phù vi khuẩn A tumefaciens
Nuôi cấy tạo khuẩn lạc: cấy trải chủng vi khuẩn A tumefaciens AGL1 mang cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 từ ống giữ chủng lên môi trường YEP đặc, có bổ sung kháng sinh chọn lọc, nuôi trong tủ ổn nhiệt 28oC trong thời gian 48 giờ Nuôi lỏng khuẩn: dùng que cấy chọn một khuẩn lạc riêng biệt trên đĩa khuẩn cấy vào môi trường YEP lỏng bổ sung các loại kháng sinh như nuôi đặc Bình nuôi lỏng được lắc 200 v/p ở 28oC trong 16 giờ ở điều kiện tối hoàn toàn trên máy lắc
Tạo dịch huyền phù vi khuẩn: dịch khuẩn thu từ quá trình nuôi lỏng được hòa loãng 2 - 3 lần và tiếp tục nuôi phục hồi 2 - 4 giờ Sau đó dịch khuẩn được ly tâm ở 5000 v/p trong 10 phút ở 4oC Loại bỏ phần dịch nổi và hòa tan cặn khuẩn trong môi trường CCM lỏng có bổ sung AS và pha loãng cho đến khi dịch khuẩn có OD660 đạt 0,8 - 1 Dịch huyền phù này được dùng cho biến nạp
- Nhiễm khuẩn và đồng nuôi cấy
Môi trường đồng nuôi cấy là CCM đặc có bổ sung AS CCM được đổ trên đĩa petri, khi khô đặt giấy thấm đã khử trùng lên trên bề mặt môi trường Mẫu được ngâm trong dịch huyền phù vi khuẩn trong thời gian 30 phút Sau thời gian nhiễm khuẩn, mẫu được chuyển sang môi trường đồng nuôi cấy CCM đặc Quá trình đồng nuôi cấy diễn ra trong tối, ở 25oC trong thời gian là 5 ngày
- Diệt khuẩn và tạo đa chồi
Mẫu biến nạp sau thời gian đồng nuôi cấy được lắc trong môi trường SIM lỏng có bổ sung 500 mg/l cefotaxime với thời gian là 10 phút, sau đó thấm khô bằng giấy thấm khử trùng Dùng panh và dao cắt bỏ chồi chính xuất hiện trên các mảnh lá mầm, cấy mẫu lên môi trường tạo cụm chồi có bổ sung 500 mg/l cefotaxime Sau thời gian 2 tuần, mẫu được chuyển sang môi trường SIM đặc có bổ sung 500 mg/l cefotaxime, 3 mg/l PPT và nuôi trong 2 tuần
- Tái sinh cây hoàn chỉnh
trường phát triển chồi SEM có bổ sung 500 mg/l cefotaxime và 3 mg/l PPT Khi các chồi phát triển đạt kích thước từ 3 - 5 cm sẽ được chuyển sang môi trường ra rễ RM có bổ sung 250 mg/l cefotaxime để tạo cây hoàn chỉnh
- Kiểm tra tính kháng thuốc trừ cỏ
Các cây đậu tương chuyển gen thế hệ T0 tái sinh trên môi trường chọn lọc được chuyển ra trồng trên giá thể và sàng lọc bằng phết thuốc trừ cỏ (200 mg/l glufosinate) trên lá có ba lá chét Sàng lọc bằng phết thuốc trừ cỏ trên lá được lặp lại 3 lần tại các vị trí khác nhau trên mỗi cây tái sinh
2 3 6 Phương pháp trồng và chăm sóc cây đậu tương trong điều kiện nhà lưới
Cây đậu tương được trồng trong các chậu nhựa (chiều cao 25 cm, đường kính 20 cm) chứa hỗn hợp TRiBAT (Công ty TNHH MTV Sài Gòn xanh, Việt Nam) và trồng trong điều kiện nhà kính ở 28-35°C với quang chu kỳ 16 giờ sáng/8 giờ tối Cây đậu tương được bón phân hai lần với NPK (15:5:20) sau khi trồng 40 ngày và NPK (16:16:16) sau khi trồng 65 ngày Hạt đậu tương được thu hoạch và bảo quản trong kho lạnh (độ ẩm 40%, 4oC) cho các thí nghiệm tiếp theo Các chỉ số sinh trưởng bao gồm chiều cao cây (cm), số nhánh, số lóng của mỗi cây được ghi lại khi cây ở giai đoạn trưởng thành (giai đoạn R8) Chiều dài lá và chiều rộng lá (cm) được đo tại các vị trí lá khác nhau ở giai đoạn phát triển R2 của cây
2 3 7 Phân tích sự di truyền của đột biến định hướng và gen chuyển các dòngđậu tương chỉnh sửa gen đậu tương chỉnh sửa gen
Kiểm tra sự tính kháng thuốc trừ cỏ của dòng đột biến
Các dòng đậu tương T0, T1, T2 được kiểm tra sự có mặt của gen chọn lọc bar
thông qua phương pháp phết thuốc trừ cỏ như mục 3 2 5 Lá của các dòng đậu tương chuyển gen ở các thế hệ khác nhau được sử dụng để tách chiết DNA tổng số theo phương pháp CTAB của Doyle và cộng sự (1991) và được sử dụng cho các phân tích tiếp theo
Kiểm tra sự có mặt của gen chuyển
Các dòng đậu tương T1, T2 được kiểm tra sự có mặt của gen chuyển thông qua phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho gen pcoCas9 và gen bar (Bảng phụ lục 1), với 35 chu kỳ khuếch đại Sản phẩm PCR của các dòng đột biến được điện di trên