Sau khi đã xây dựng thành công hệ thống chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo định hướng trên các gen mã hóa enzyme galactinol synthase, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra hoạt động của hệ thống này thông qua hệ thống cảm ứng và chuyển gen thông qua rễ tơ Kết quả khẳng định khả năng hoạt động và tính chính xác của các cấu trúc CRISPR/Cas9 đã thiết kế Tiếp theo, hệ thống vector này được sử dụng để chuyển vào các giống đậu tương lựa chọn nhằm tạo dòng đậu tương triển vọng mang đột biến định hướng trên các gen quan tâm
3 3 1 Tạo cây đậu tương chuyển gen thông qua vi khuẩn A tumefaciens
Giống đậu tương ĐT26 được trồng phổ biến, có khả năng kháng bệnh gỉ sắt, đốm nâu và khả năng chịu ruồi đục thân, chống đổ khá, năng suất cao được đánh giá là giống ưu tú của Việt Nam, là đối tượng nghiên cứu được chọn để tạo cây đậu tương đột biến nhằm tăng chất lượng hạt, ứng dụng trong công tác phát triển giống mới Giống đậu tương Mr được sử dụng như giống cây mô hình cho quy trình chuyển gen
Chủng vi khuẩn A tumefaciens AGL1 mang vector pFGC5941/G03-19 được sử dụng để chuyển gen vào đậu tương thông qua nốt lá mầm hạt trưởng thành của hai giống đậu tương ĐT26 và Mr theo phương pháp đã được tối ưu của Phòng Công nghệ tế bào thực vật - Viện CNSH [87] [90]
Với tổng lượng mẫu biến nạp là 1082, sau 2 lần chọn lọc liên tiếp ở giai đoạn cảm ứng tạo chồi với nồng độ glufosinate 6 mg/l và 3 lần chọn lọc ở giai đoạn kéo dài chồi với nồng độ glufosinate 3 mg/l đã thu được 14 chồi kéo dài với giống ĐT26 và 14 chồi với giống Mr, các chồi đạt chiều cao 2,5–3,5 cm và có các lá chính được cắt sang môi trường tạo rễ Sau 7-10 ngày, các chồi có bộ rễ hoàn chỉnh được trồng trên giá thể TN1 bổ sung 25% TRiBAT
Sau quá trình thích nghi sinh trưởng trong buồng sinh trưởng nhiệt độ 28oC, độ ẩm 80%, quang chu kỳ 16 giờ sáng/8 giờ tối, đã thu được tổng số 16 cây đậu tương hoàn chỉnh ngoài giá thể của hai giống nghiên cứu Kết quả chuyển gen vào đậu tương
được trình bày ở Hình 3 12 và Bảng 3 2
Hình 3 12 Minh họa quá trình chuyển gen vào đậu tương
thông qua nốt lá mầm
A Mảnh lá mầm đồng nuôi cấy 5 ngày, B Mảnh lá mầm sau 14 ngày chọn lọc, C Mảnh lá mầm sau 28 ngày chọn lọc, D Chồi kéo dài trên môi trường chọn lọc,
E Lá cây DT 1 1 (+) với ppt 200 mg/l, F Lá cây ĐT26 (-) với ppt 200 mg/l, G Cây chuyển gen 25 ngày tuổi
Bảng 3 2 Kết quả chuyển gen của giống ĐT26 và Mr
3 3 2 Sàng lọc cây chuyển gen bằng phết thuốc diệt cỏ và PCR
Việc chuyển gen thành công bước đầu được xác định thông qua phương pháp phết lá với thuốc diệt cỏ glufosinate nồng độ 200 mg/l, sau đó được xác nhận bằng
Giống đậu tương Số mẫu biến nạp Số mẫu tạo đa chồi Số chồi kéo dài Số chồi tạo rễ Số cây sống trên giá thể ĐT26 606 300 14 8 8 Mr 476 289 14 8 8
sàng lọc PCR sự có mặt của trình tự T-DNA sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen
pcoCas9 và vùng mở rộng 35SPPDK – pFGC trong vector chuyển gen, cụ thể tại Bảng phụ lục 1 Các dòng đậu tương T0 được phết trực tiếp glufosinate 200 mg/l trên bề mặt lá Sau 3 ngày phết thuốc diệt cỏ, phần lá tại vị trí phết của cây đối chứng và một số dòng chuyển gen co lại, mất dần sắc tố xanh lục của lá và chuyển vàng; và sau 5 ngày phết, vị trí lá thử chất diệt cỏ chuyển sang vàng nâu, cháy khô (Hình 3 12F) Bên cạnh đó, một số dòng chuyển gen không xuất hiện dấu hiệu gây hại của chất diệt cỏ tại vị trí thử, lá không bị mất màu màu sắc (Hình 3 12E)
Tổng hợp kết quả sau khi sàng lọc bằng thuốc diệt cỏ, đã thu được 3 dòng đậu tương chuyển gen thế hệ T0 không mẫn cảm với glufosinate 200 mg/l, trong đó có 1 dòng thuộc giống ĐT26 (DT1 1) và 2 dòng thuộc giống Mr (M3 1 và M4 1) (Bảng phụ lục 2) Tất cả các dòng đậu tương phát triển tốt trên giá thể cũng được thu lá và tiến hành kiểm tra bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu (Bảng phụ lục 1) Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1% cho kết luận tương tự như kết quả sử dụng phương pháp phết lá với thuốc diệt cỏ (Bảng phụ lục 2)
Như vậy, chúng tôi đã chuyển thành công cấu trúc chỉnh sửa hệ gen vào hai giống đậu tương ĐT26 và Mr Các dòng đậu tương mang cấu trúc CRISPR/Cas9 tiếp tục được sử dụng để xác định và phân tích các đột biến định hướng trên các gen
GmGOLS ở các bước tiếp theo
3 3 3 Xác định và phân tích các đột biến gen thu được trên cây đậu tương chuyểngen T0 gen T0
Sau khi xác định sự có mặt của hai gen chỉ thị, chúng tôi khuếch đại đặc hiệu vùng gen GmGOLS03 và GmGOLS19 từ DNA các dòng chuyển gen T0 và tiến hành biến tính - hồi tính sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide để xác định việc chỉnh sửa các gen định hướng
Kết quả thể hiện ở Hình 3 13 đã xác định được 03 dòng đậu tương đột biến, trong đó ghi nhận đột biến đồng thời ở cả hai gen đích (GmGOLS03 và GmGOLS19) ở 3 dòng T0 được kiểm tra (D1 1, M3 1, M4 1) Các băng vạch có kích thước khác với băng vạch xuất hiện ở mẫu đối chứng được ghi nhận xuất hiện ở cả ba mẫu T0 được kiểm tra cho cả hai gen, cho thấy hiệu quả cao trong việc chỉnh sửa hệ gen đậu tương sử dụng cấu trúc CRISPR/Cas9 đã thiết kế
Hình 3 13 Phân tích sản phẩm PCR của các dòng đậu tương đột biến gen thế hệ T0
bằng kỹ thuật biến tính - hồi tính trên gel polyacrylamide 15%
Mr: cây đối chứng giống Mr; DT: cây đối chứng giống ĐT26; M3 1, M4 1:các dòng đột biến giống Mr; D1 1: dòng đột biến giống ĐT26; M: thang DNA 100 bp
Các đột biến được phân tích thông qua tách dòng và giải trình tự vùng gen đích ở các cây T0 Tương thích với kết quả phân tích PAGE, dữ liệu giải trình tự cho thấy các đột biến khác nhau được xẩy ra ở hai gen GmGOLS (Hình 3 14) Kích thước của đoạn mất thay đổi từ ∆-7 bp đến ∆-77 bp Dòng DT1 1 chứa các thể khảm
(chimeric) cho cả gen GmGOLS03 và GmGOLS19 Hai mẫu tách dòng mang đột biến mất đoạn lớn (∆-77 và ∆-32 bp) cũng như không đột biến ở gen GmGOLS03 đã được xác định từ dòng DT1 1
Ngoài ra, chúng tôi cũng tìm thấy alen kiểu dại và hai alen đột biến (∆-7 bp và ∆-23 bp) trong gen GmGOLS19 ở dòng DT1 1 Các đoạn mất dự kiến ở hai gen
GmGOLS03 và GmGOLS19 cũng được quan sát thấy ở các dòng đậu tương chuyển gen M3 1 và M4 1 thuộc giống Mr Điều đáng chú ý là tất cả ba dòng chuyển gen đều chứa đột biến mất đoạn ∆-23 bp giống hệt nhau giữa hai vị trí cắt Cas9 trong gen
GmGOLS19 Ngoài ra, hầu hết các dạng đột biến mất đoạn được phát hiện (8/9) đều nằm giữa hai vị trí đích, thể hiện độ chính xác của cấu trúc CRISPR/Cas9 được thiết kế trong việc chỉnh sửa bộ gen đậu tương
Hình 3 14 Trình tự của các vùng trình tự đích trên gen GmGOLS03 (A) và gen
GmGOLS19 (B) ở cây T0
Các trình tự đích (sgRNAs) được thể hiện bằng màu đỏ, các trình tự PAM được đánh dấu xanh nước biển DT1 1: dòng đột biến giống ĐT26; M3 1, M4 1: các dòng đột biến giống Mr; a/b/c/d/e: các alen khác nhau ở mỗi dòng T0; ∆ thể hiện sự thay đổi trong trình tự đích: không thay đổi (0),mất nucleotide (-), thêm
nucleotide (+)
Như vậy, kết quả PAGE và phân tích trình tự chỉ ra rằng tất cả các dòng đậu tương chuyển gen T0 (3/3) được tạo ra từ hai giống ĐT26 và Mr đều mang đột biến gây ra bởi CRISPR/Cas9 trong gen GmGOLS03 và GmGOLS19 Ngoài locus
GmGOLS19 của dòng M3 1, tất cả các vùng khác đều chứa hai hoặc nhiều alen đột biến cho thấy sự xuất hiện của các thể khảm, do đó đòi hỏi phải sàng lọc thêm thế hệ tiếp theo để xác định tính di truyền của các đột biến và lựa chọn các đột biến ổn định
3 4 Sàng lọc các dòng đậu tương chỉnh sửa gen qua các thế hệ T1 và T2
Sau khi thu được các dòng cây đột biến và phân tích trình tự các đột biến nhận được trên 2 gen quan tâm, các dòng đậu tương mang đột biến này được chăm sóc trong điều kiện nhà lưới và tiến hành thu hạt ở các thể hệ khác nhau để đánh giá khả năng di truyền, tính phân ly của các đột biến định hướng Do hai giống đậu tương ĐT26 và Mr có đặc điểm sinh trưởng và yêu cầu chăm sóc khác nhau thế nên các dòng cây thuộc hai giống này được tiến hành phân tích riêng
3 4 1 Dòng DT 1 1 của giống ĐT26
3 4 1 1 Phân tích sự di truyền, phân ly của gen chọn lọc bar ở thế hệ T1
Hệ thống vector chuyển gen CRISPR/Cas9 được thiết kế dùng tạo đột biến có chứa gen chọn lọc bar nhằm bước đầu xác định các dòng cây mang gen chuyển Thông qua phương pháp phết lá với thuốc diệt cỏ glufosinate nồng độ 200 mg/l, sau đó được xác nhận bằng sàng lọc PCR sự có mặt của trình tự T-DNA sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen pcoCas9 và vùng mở rộng 35SPPDK – pFGC trong gen chuyển cụ thể tại Bảng phụ lục 1 Các dòng đậu tương thế hệ T1 được phết trực tiếp glufosinate 200 mg/l trên bề mặt lá
Kết quả sau thí nghiệm thu được 29 cây đậu tương đột biến thế hệ T1 của dòng DT1 1 thuộc giống ĐT26 không mẫn cảm với glufosinate 200 mg/l, phân tích mẫu các cây T1 bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu (Bảng phụ lục 1), sản phẩm PCR phân tích điện trên gel agarose 1% cho kết quả dương tính với gen bar Kết hợp với kết quả sử dụng phương pháp phết lá với thuốc diệt cỏ (Bảng phụ lục 2) đã chứng minh gen chuyển bar được di truyền và phân ly ở các dòng đột biến thuộc thế hệ T1
3 4 1 2 Sự di truyền, phân ly của đột biến các gen GmGOLS ở thế hệ T1
Các dòng T0 được trồng trong điều kiện nhà lưới và thu hạt để đánh giá sự di truyền của các alen GmGOLS đột biến ở thế hệ T1 Dựa vào kết quả điện di trên gel agarose đã xác định được sự phân ly của đột biến mất đoạn lớn (∆-23 bp và ∆-77 bp) trên gen GmGOLS03 và GmGOLS19 ở thế hệ T1 của dòng chuyển gen DT1 1 (Hình 3 15A)
hiện của hai băng vạch; tuy nhiên tất cả đều thấp hơn băng vạch khuếch đại của cây đối chứng Ngoài ra, bốn cây T1 chỉ có một băng vạch trên và những cây còn lại chỉ có một băng vạch dưới tương ứng kiểu gen đồng hợp tử với hai dạng đột biến này
Đối với gen GmGOLS19, 8 cây T1 xuất hiện hai băng vạch, trong khi 5 cây khác chỉ mang một băng vạch dưới và hai cây còn lại mang một băng vạch trên (Hình 3 15A) Điều quan trọng là hai cây T1 (DT1 1-5 và DT1 1-6) chỉ có băng vạch dưới của cả hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19, chứng tỏ các dòng này bị mất đoạn lớn ở cả hai gen GmGOLS
Hình 3 15 Sự phân ly của các đột biến ở thế hệ T1 và T2 của dòng DT1 1
(A) và (B) lần lượt là kết quả điện di sản phẩm PCR của các trình tự đích trên gen GmGOLS03 và GmGOLS19 ở thế hệ T1 và T2 WT: cây đối chứng giống ĐT26; DT1 1-1 đến DT1 1-15: cây T1 của dòng đột biến DT1 1; M: thang DNA 1 kb ở ảnh
cây T1 và thang DNA 100 bp ở ảnh cây T2; DT1 1-5-1 đến DT1 1-5-6: cây T2 từ dòng DT1 1-5; DT1 1-7-1 đến DT1 1-7-5: cây T2 từ dòng DT1 1-7
Kết quả giải trình tự vùng gen quan tâm của các dòng T1 được lựa chọn (DT1 1-2, DT1 1-5, DT1 1-6, DT 1-7, DT1 1-13, DT1 1-14) cho thấy: các cây đột biến gen phân ly ở thế hệ T1 thuộc các dòng DT1 1-5, DT1 1-6, DT1 1-13 đều mang đột biến kép ở cả hai gen GmGOLS, trong khi những dòng còn lại DT1 1-2, DT1 1-7 và DT1 1-14 là đột biến biallelic/đồng hợp tử trên gen GmGOLS03 và đột biến dị hợp tử trên gen GmGOLS19 (Hình 3 16) Kết quả giải trình tự vùng gen đích của
(Hình 3 15A) Các dòng DT1 1-5, DT1 1-6 và DT1 1-14 mang đột biến mất đoạn ∆- 77 bp, trong khi DT1 1-7 và DT1 1-13 mang đột biến ∆-32 bp
Hình 3 16 Kết quả phân tích sự phân ly của các đột biến trên gen GmGOLS GmGOLS03 (A) và GmGOLS19 (B) ở thế hệ T1 của các dòng DT1 1, M3 1 và M4 1 Vùng chỉnh sửa đích được đánh dấu màu đỏ (sgRNAs); vùng PAM được đánh
dấu màu xanh; ∆ thể hiện sự thay đổi trong trình tự đích: không thay đổi (0), mất nucleotide (-),thêm nucleotide (+)
Ngoài ra, dòng DT1 1-2 chứa cả hai đột biến mất đoạn ∆-32 bp và ∆-77 bp (biallelic) Giải trình tự gen GmGOLS19 cho thấy các dòng T1 mang alen wild-type và alen ∆-23 bp; DT1 1-5, DT1 1-6, DT1 1-13 là dòng đột biến đồng hợp tử trong khi DT1 1-2, DT1 1-7 và DT1 1-14 là dòng đột biến dị hợp tử
Như vậy, ở thế hệ T1 đối với giống ĐT26, đã thu được 03 dòng đột biến đồng hợp tử ở cả hai gen GmGOLS Ngoài ra, không ghi nhận được alen wild-type nào của gen GmGOLS03 ở tất cả các dòng T1 được kiểm tra, mặc dù chúng xuất hiện ở thế hệ T0 (DT1 1) (Hình 3 14, Hình 3 16); điều này đồng nghĩa với việc không thu được dòng đột biến đơn gen GmGOLS19 Các đặc điểm kiểu gen và kiểu hình tiếp theo sẽ được thực hiện trên các dòng đột biến đơn GmGOLS03 và dòng đột biến kép
GmGOLS03, GmGOLS19
3 4 1 3 Sự di truyền, phân ly của thế hệ cây T2 của dòng DT 1 1 giống ĐT26
Sự di truyền ổn định của tất cả các alen đột biến trên gen GmGOLS03 và
GmGOLS19 của dòng DT1 1 tiếp tục được đánh giá ở các dòng thuộc thế hệ T2 (Hình 3 15 B, Hình3 17)
Hình 3 17 Sự phân ly của các đột biến trên gen GOLS ở thế hệ T2 của dòng DT1 1 (A) GmGOLS03 và (B) GmGOLS19
Vùng chỉnh sửa đích được đánh dấu màu đỏ (sgRNAs); vùng PAM được đánh dấu màu xanh; ∆ thể hiện sự thay đổi trong trình tự đích: không thay đổi (0), mất
nucleotide (-), thêm nucleotide (+)
được duy trì ổn định ở thế hệ này (mất đoạn 77 bp ở gen GmGOLS03 và -23 bp ở gen
GmGOLS19) Dòng DT1 1-7, DT1 1-14 được sàng lọc để thu được cá thể mang đột biến đồng hợp tử ở gen GmGOLS03 và không mang đột biến ở gen GmGOLS19
Kết hợp kết quả phân tích sự phân ly và giải trình tự đã thu được dòng DT1 1- 7-1 mang đột biến đồng hợp tử đồng thời ở hai gen (-32 bp ở gen GmGOLS03 và -23 bp ở gen GmGOLS19), dòng DT1 1-7-2 mang đột biến đồng hợp tử chỉ ở gen
GmGOLS03 (-32 bp ở gen GmGOLS03) và không mang đột biến ở gen GmGOLS19, và dòng DT1 1-14-3 mang đột biến đồng hợp tử chỉ ở gen GmGOLS03 (-77 bp ở gen
GmGOLS03) và không mang đột biến ở gen GmGOLS19
Như vậy, kết quả phân tích ở hệ T2 đã khẳng định sự di truyền ổn định của các đột biến định hướng của gen GmGOLS trên các dòng đậu tương có nguồn gốc từ giống ĐT26 Chúng tôi đã thu được các dòng đậu tương mang đột biến đồng hợp trên đơn gen hoặc cả hai gen nghiên cứu để phục vụ cho các phân tích về sinh trưởng, phát triển cũng như thành phần hạt ở các nghiên cứu tiếp theo
3 4 2 Các dòng M3 1 và M4 1 của giống Marverick