4. Những đóng góp mới của luận án
1.3.2. Cơ chế hoạt động của hệ thống chỉnh sửa gen CRISRP/Cas9
Với hệ CRISPR/Cas9, các trình tự CRISPR và vùng đệm được phiên mã thành crRNA (CRISPR-RNA). Sau đó phân tử crRNA này được cắt lọc một số phần và hoàn thiện cấu trúc tạo thành phân tử tracrRNA đầy đủ chức năng dẫn đường cho Cas9 đến cắt DNA ở vị trí xác định. Quá trình biến đổi này được xúc tác bởi enzyme
RNase III. crRNA chứa một trình tự phiên mã của CRISPR và DNA ngoại lai. Nó đóng vai trò nhận biết chính xác vị trí cắt trên trình tự của DNA ngoại lai. Sự kết hợp giữ crRNA bám vào tracrRNA tạo ra một phức hệ thông minh (crRNA/tracrRNA hay hay guide RNA) vừa có thể cho Cas9 biết chính xác vị trí và thực hiện cắt phân tử DNA ngoại lai tại vị trí đó [52]. Tuy nhiên, để Cas9 có thể bám vào sợi xoắn kép DNA ngoài sự có mặt của crRNA cần phải có thêm sự hiện diện của một motif nằm cạnh tiền vùng đệm (proto-spacer adjacent motif) hay viết tắt là PAM. Cas9 chỉ có thể bám vào sợi xoắn kép DNA nếu một trình tự PAM có ba nucleotide có chứa hai guanine và một base bất kỳ khác nằm cạnh trình tự nhận diện. Khi phức hệ Cas9 và gRNA được hình thành và bám vào vùng định hướng của DNA ngoại lai, hai mạch của DNA bị tháo xoắn và phân tử crRNA/tracrRN gắn bổ sung với trình tự định hướng (target) trên DNA sợi đơn. Protein Cas9 sau đó thực hiện cắt đặc hiệu tại hai sợi đơn DNA ở cùng một vị trí cách trình tự PAM từ 2-3 nucleotides [53], Hình 1.6
Hình 1.6. Cơ chế hoạt động của CRISPR/Cas9 trong trường hợp gây biến đổi trình tự gen [51]
Nếu có một đoạn DNA mẫu (template DNA, hay donor DNA) tương đồng với vị trí mục tiêu thì DNA sợi đôi bị đứt gãy này có thể được sửa chữa bằng cơ chế HDR. Phần DNA ở quanh vị trí đứt gãy sẽ được thay thế bằng phần DNA tương ứng ở DNA mẫu. Nếu một đột biến được chủ ý đưa vào DNA mẫu thì đoạn DNA sau khi
sửa chữa sẽ mang đột biến đó (Hình 1.7A) [51].
Khi mẫu DNA có số lượng lớn cơ chế chỉnh sửa theo hướng HDR và NHEJ, có thể cùng xảy ra đồng thời dẫn tới hiện tượng chèn/xóa đoạn không mong muốn. Khi đó biến thể của Cas9 là Cas9D10A sẽ hạn chế điều này. Cas9D10A khác với Cas9 thông thường là nó chỉ có khả năng cắt trên một mạch DNA thay vì hai mạch, do đó không kích hoạt cơ chế NHEJ mà việc sửa chữa DNA chỉ được tiến hành theo cơ chế HDR [54]. Nếu sử dụng từ hai phức hợp Cas9D10A để tạo nên các vị trí đứt gãy sợi đơn (nick) cạnh nhau sẽ làm tăng sự đặc hiệu mục tiêu [55] (Hình 1.7)
Biến thể thứ ba của Cas9 là nuclease-deficient Cas9 (dCas9) (Hình 1.7C) không có khả năng cắt DNA). Các đột biến xảy ra với HNH và RuvC domain bất hoạt khả năng cắt DNA, nhưng vẫn giữ lại khả năng liên kết với DNA. Ứng dụng của biến thể này là biến dCas9 thành công cụ hoạt hóa hoặc ức chế phiên mã khi dung hợp dCas9 với các domain tác động (hoạt hóa hoặc ức chế). Ngoài ra, có thể lợi dụng khả năng bắt cặp đặc hiệu trình tự của dCas9 với DNA để hiển thị trình tự DNA mong muốn trên genome bằng cách dung hợp dCas9 với protein huỳnh quang [56]. Nhờ những biến thể trên CRISPR/Cas9 ngày càng được sử dụng rộng trong việc tạo ra thực vật biến đổi gen với hiệu quả cao.