4. Những đóng góp mới của luận án
3.4.1 Dòng DT1.1 của giống ĐT26
3.4.1.1. Phân tích sự di truyền, phân ly của gen chọn lọc bar ở thế hệ T1
Hệ thống vector chuyển gen CRISPR/Cas9 được thiết kế dùng tạo đột biến có chứa gen chọn lọc bar nhằm bước đầu xác định các dòng cây mang gen chuyển. Thông qua phương pháp phết lá với thuốc diệt cỏ glufosinate nồng độ 200 mg/l, sau đó được xác nhận bằng sàng lọc PCR sự có mặt của trình tự T-DNA sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen pcoCas9 và vùng mở rộng 35SPPDK – pFGC trong gen chuyển cụ thể tại Bảng phụ lục 1. Các dòng đậu tương thế hệ T1 được phết trực tiếp glufosinate 200 mg/l trên bề mặt lá.
Kết quả sau thí nghiệm thu được 29 cây đậu tương đột biến thế hệ T1 của dòng DT1.1 thuộc giống ĐT26 không mẫn cảm với glufosinate 200 mg/l, phân tích mẫu các cây T1 bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu (Bảng phụ lục 1), sản phẩm PCR phân tích điện trên gel agarose 1% cho kết quả dương tính với gen bar. Kết hợp với kết quả sử dụng phương pháp phết lá với thuốc diệt cỏ (Bảng phụ lục 2) đã chứng minh gen chuyển bar được di truyền và phân ly ở các dòng đột biến thuộc thế hệ T1.
3.4.1.2 Sự di truyền, phân ly của đột biến các gen GmGOLS ở thế hệ T1
Các dòng T0 được trồng trong điều kiện nhà lưới và thu hạt để đánh giá sự di truyền của các alen GmGOLS đột biến ở thế hệ T1. Dựa vào kết quả điện di trên gel agarose đã xác định được sự phân ly của đột biến mất đoạn lớn (∆-23 bp và ∆-77 bp) trên gen GmGOLS03 và GmGOLS19 ở thế hệ T1 của dòng chuyển gen DT1.1 (Hình 3.15A).
hiện của hai băng vạch; tuy nhiên tất cả đều thấp hơn băng vạch khuếch đại của cây đối chứng. Ngoài ra, bốn cây T1 chỉ có một băng vạch trên và những cây còn lại chỉ có một băng vạch dưới tương ứng kiểu gen đồng hợp tử với hai dạng đột biến này.
Đối với gen GmGOLS19, 8 cây T1 xuất hiện hai băng vạch, trong khi 5 cây khác chỉ mang một băng vạch dưới và hai cây còn lại mang một băng vạch trên (Hình 3.15A). Điều quan trọng là hai cây T1 (DT1.1-5 và DT1.1-6) chỉ có băng vạch dưới của cả hai gen GmGOLS03 và GmGOLS19, chứng tỏ các dòng này bị mất đoạn lớn ở cả hai gen GmGOLS.
Hình 3.15.Sự phân ly của các đột biến ở thế hệ T1 và T2 của dòng DT1.1
(A) và (B) lần lượt là kết quả điện di sản phẩm PCR của các trình tự đích trên gen GmGOLS03 và GmGOLS19 ở thế hệ T1 và T2. WT: cây đối chứng giống ĐT26; DT1.1-1 đến DT1.1-15: cây T1 của dòng đột biến DT1.1; M: thang DNA 1 kb ở ảnh
cây T1 và thang DNA 100 bp ở ảnh cây T2; DT1.1-5-1 đến DT1.1-5-6: cây T2 từ dòng DT1.1-5; DT1.1-7-1 đến DT1.1-7-5: cây T2 từ dòng DT1.1-7
Kết quả giải trình tự vùng gen quan tâm của các dòng T1 được lựa chọn (DT1.1-2, DT1.1-5, DT1.1-6, DT.1-7, DT1.1-13, DT1.1-14) cho thấy: các cây đột biến gen phân ly ở thế hệ T1 thuộc các dòng DT1.1-5, DT1.1-6, DT1.1-13 đều mang đột biến kép ở cả hai gen GmGOLS, trong khi những dòng còn lại DT1.1-2, DT1.1-7 và DT1.1-14 là đột biến biallelic/đồng hợp tử trên gen GmGOLS03 và đột biến dị hợp tử trên gen GmGOLS19 (Hình 3.16). Kết quả giải trình tự vùng gen đích của
(Hình 3.15A). Các dòng DT1.1-5, DT1.1-6 và DT1.1-14 mang đột biến mất đoạn ∆- 77 bp, trong khi DT1.1-7 và DT1.1-13 mang đột biến ∆-32 bp.
Hình 3.16. Kết quả phân tích sự phân ly của các đột biến trên gen GmGOLS GmGOLS03(A) và GmGOLS19 (B) ở thế hệ T1 của các dòng DT1.1, M3.1 và M4.1. Vùng chỉnh sửa đích được đánh dấu màu đỏ (sgRNAs); vùng PAM được đánh
dấu màu xanh; ∆ thể hiện sự thay đổi trong trình tự đích: không thay đổi (0), mất nucleotide (-),thêm nucleotide (+).
Ngoài ra, dòng DT1.1-2 chứa cả hai đột biến mất đoạn ∆-32 bp và ∆-77 bp (biallelic). Giải trình tự gen GmGOLS19 cho thấy các dòng T1 mang alen wild-type và alen ∆-23 bp; DT1.1-5, DT1.1-6, DT1.1-13 là dòng đột biến đồng hợp tử trong khi DT1.1-2, DT1.1-7 và DT1.1-14 là dòng đột biến dị hợp tử.
Như vậy, ở thế hệ T1 đối với giống ĐT26, đã thu được 03 dòng đột biến đồng hợp tử ở cả hai gen GmGOLS. Ngoài ra, không ghi nhận được alen wild-type nào của gen GmGOLS03 ở tất cả các dòng T1 được kiểm tra, mặc dù chúng xuất hiện ở thế hệ T0 (DT1.1) (Hình 3.14, Hình 3.16); điều này đồng nghĩa với việc không thu được dòng đột biến đơn gen GmGOLS19. Các đặc điểm kiểu gen và kiểu hình tiếp theo sẽ được thực hiện trên các dòng đột biến đơn GmGOLS03 và dòng đột biến kép
GmGOLS03, GmGOLS19.
3.4.1.3 Sự di truyền, phân ly của thế hệ cây T2 của dòng DT 1.1 giống ĐT26
Sự di truyền ổn định của tất cả các alen đột biến trên gen GmGOLS03 và
GmGOLS19 của dòng DT1.1 tiếp tục được đánh giá ở các dòng thuộc thế hệ T2 (Hình 3.15 B, Hình3.17).
Hình 3.17. Sự phân ly của các đột biến trên gen GOLS ở thế hệ T2 của dòng DT1.1
(A) GmGOLS03 và (B) GmGOLS19
Vùng chỉnh sửa đích được đánh dấu màu đỏ (sgRNAs); vùng PAM được đánh dấu màu xanh; ∆ thể hiện sự thay đổi trong trình tự đích: không thay đổi (0), mất
nucleotide (-), thêm nucleotide (+)
được duy trì ổn định ở thế hệ này (mất đoạn 77 bp ở gen GmGOLS03 và -23 bp ở gen
GmGOLS19). Dòng DT1.1-7, DT1.1-14 được sàng lọc để thu được cá thể mang đột biến đồng hợp tử ở gen GmGOLS03 và không mang đột biến ở gen GmGOLS19.
Kết hợp kết quả phân tích sự phân ly và giải trình tự đã thu được dòng DT1.1- 7-1 mang đột biến đồng hợp tử đồng thời ở hai gen (-32 bp ở gen GmGOLS03 và -23 bp ở gen GmGOLS19), dòng DT1.1-7-2 mang đột biến đồng hợp tử chỉ ở gen
GmGOLS03 (-32 bp ở gen GmGOLS03) và không mang đột biến ở gen GmGOLS19, và dòng DT1.1-14-3 mang đột biến đồng hợp tử chỉ ở gen GmGOLS03 (-77 bp ở gen
GmGOLS03) và không mang đột biến ở gen GmGOLS19.
Như vậy, kết quả phân tích ở hệ T2 đã khẳng định sự di truyền ổn định của các đột biến định hướng của gen GmGOLS trên các dòng đậu tương có nguồn gốc từ giống ĐT26. Chúng tôi đã thu được các dòng đậu tương mang đột biến đồng hợp trên đơn gen hoặc cả hai gen nghiên cứu để phục vụ cho các phân tích về sinh trưởng, phát triển cũng như thành phần hạt ở các nghiên cứu tiếp theo.