6. Bố cục uận vn
2.2.2. Đặc tính hóa lý
a. X n ẩm v m lượn tro ằn p ươn p p tr n lượn * X n ẩm
- Nguyên tắc: Sấy mẫu đến khối ƣợng kh ng đổi, cân phần khối ƣợng
còn lại, ta xác định đƣợc độ ẩm của nguyên liệu.
- Cách ti n hành: Sấy cốc sứ trong tủ sấy ở nhiệt độ 105oC đến trọng ƣợng kh ng đổi, ùng c n ph n t ch để xác định trọng ƣợng cốc cân là mo
(g). Lấy một khối ƣợng xác định bột thân cây mật gấu và đem c n tr n c n ph n t ch đƣợc m1 (g).
Đặt cốc mẫu vào tủ sấy và điều chỉnh ở nhiệt độ 90o
C trong thời gian khoảng 3 giờ, sau đ lấy cốc mẫu ra để nguội 15 phút trong bình hút ẩm có chất hút ẩm. Cân cốc mẫu đã sấy.
C n xong để cốc vào sấy tiếp khoảng 2 giờ thì cân lại lần nữa cho đến khi trọng ƣợng cốc mẫu giữa các lần sấ kh ng tha đổi. Ghi nhận khối ƣợng m2(g). Công thức t nh độ ẩm (W): W (%) = 1 2 1 100(%) o m m m m Với:
m0: khối ƣợng cốc sau khi sấ đến khối ƣợng kh ng đổi. m1: khối ƣợng mẫu trƣớc khi sấy.
m2: khối ƣợng cốc và mẫu sau khi sấ đến khối ƣợng kh ng đổi.
* X n m lượng tro
- Nguyên tắc: Đốt cháy và nung nấu bột nguyên liệu ở nhiệt độ 6000C đến khối ƣợng không đổi. Độ chênh lệch khối ƣợng trƣớc và sau khi đem tro h a ch nh à hàm ƣợng hữu cơ ị đốt cháy, tro còn lại chứa chất v cơ.
- Cách ti n hành: Đặt chén nung vào ò đã đƣợc đốt nóng, giữ trong 60
phút ở nhiệt độ 6000C, sau đ ấ ra và đặt vào bình hút ẩm khi nhiệt độ ở trong bình hút ẩm ngang bằng với nhiệt độ m i trƣờng. Tiến hành cân chén nung với sai số kh ng vƣợt quá 0.001 g. Khối ƣợng cốc là mo (g).
Cân mẫu bột nguyên liệu cho vào chén nung, sau đ đặt lên bếp điện và nung ở nhiệt độ 1000C cho đến khi mất nƣớc hoàn toàn. Đặt chén vào lò nung ở nhiệt độ 6000
C trong khoảng 60 phút, làm nguội trong bình hút ẩm ở nhiệt độ m i trƣờng rồi đem c n. Quá trình nà ặp đi ặp lại cho đến khi hiệu quả hai lần cân cuối cùng kh ng vƣợt quá 0.001 g. Ghi lại giá trị khối ƣợng nhỏ nhất. Khối ƣợng cốc và tro sau khi nung là m2 (g).
Xử lí kết quả:
àm ƣợng tro (X) tính bằng phần tr m khối ƣợng của chất khô còn lại so với khối ƣợng chất kh an đầu:
X (%) = 2 0 1 ( ) 100(%) m m m Trong đ : mo là khối ƣợng cốc (g)
m1 là khối ƣợng bột thân cây mật gấu đem phân tích (g). m2 là khối ƣợng cốc và tro sau khi nung (g).
X à hàm ƣợng tro (%).
b. X n m lượn k m loạ ằn p ươn p p ấp t n u ên t AAS [20]
* Phƣơng pháp ph n t ch ựa tr n cơ sở đo phổ hấp thụ nguyên tử của một nguyên tố đƣợc gọi à phép đo phổ hấp thụ nguyên tử (phép đo S). Cơ sở lý thuyết của phép đo nà à sự hấp thụ n ng ƣợng (bức xạ đơn sắc) của nguyên tử tự do ở trạng thái hơi (kh ) khi chiếu chùm tia bức xạ qua đám hơi của nguyên tố ấ trong m i trƣờng hấp thụ.Vì thế nguyên tắc của phƣơng pháp này dựa tr n a ƣớc ch nh nhƣ sau:
- Quá trình nguyên tử hóa mẫu: Trong ƣớc này cần chọn các điều kiện và một loại trang bị phù hợp để chuyển mẫu phân tích từ trạng thái an đầu (rắn hay dung dịch) thành trạng thái hơi của các nguyên tử tự do. Những trang bị để thực hiện quá trình nà đƣợc gọi là hệ thống nguyên tử hóa mẫu. Nhờ đ ta c đƣợc đám hơi của các nguyên tử tự do của mẫu ph n t ch. Đám hơi nà ch nh à m i trƣờng hấp thụ bức xạ và sinh ra phổ hấp thụ nguyên tử.
- Quá trình tạo phổ hấp thu nguyên tử AAS: Chiếu chùm tia sáng phát xạ của nguyên tố cần ph n t ch qua đám hơi ngu n tố cần xác định trong đám hơi ngu n tử vừa điều chế ở trên. Các nguyên tử của nguyên tố cần xác định trong đám hơi sẽ hấp thụ những tia bức xạ nhất định và tạo ra phổ hấp thụ của nó. Ở đ , phần cƣờng độ của chùm tia sáng đã ị một loại nguyên tử hấp thụ là phụ thuộc vào nồng độ của n trong m i trƣờng hấp thụ. Nguồn cung cấp chùm tia sáng phát xạ của nguyên tố cần nghiên cứu đƣợc gọi là nguồn phát bức xạ đơn sắc hay bức xạ cộng hƣởng.
- Quá trình thu phân li và chọn vạch phổ hấp thụ đặc trƣng của nguyên tố cần nghiên cứu để đo cƣờng độ của n . Cƣờng độ đ ch nh à t n hiệu hấp thụ của vạch phổ hấp thụ. Trong một giới hạn nhất định của nồng độ giá trị cƣờng độ này là phụ thuộc tính vào nồng độ C của nguyên tố ở trong mẫu phân tích.
* Cách tiến hành: Tro thu đƣợc đem hòa tan ằng dung dịch nƣớc cƣờng toan, định mức bằng nƣớc cất đến 100 ml. Lấy dung dịch đã định mức trên đem xác định hàm ƣợng một số kim loại nặng là Cu, Cd, Pb, As, Hg, Zn bằng phƣơng pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử (AAS) tại phòng thí nghiệm khoa Sinh - M i trƣờng, trƣờng Đại học Sƣ phạm - Đại học Đà ẵng.
2.2.3. Phƣơng pháp chi t soxhlet [15]
* Ngu n tắc: Chiết soxhlet là một kiểu chiết liên tục đƣợc thực hiện nhờ cấu tạo đặc biệt của dụng cụ chiết. Kiểu chiết nà cũng nhƣ à kiểu chiết lỏng - lỏng nên về bản chất của quá trình chiết à tu n theo định luật phân bố chất trong hai pha không trộn lẫn vào nhau. Trong đ pha rắn nằm trong mẫu sẽ đƣợc hòa tan bởi pha lỏng gọi là dung môi.
* Cách ti n hành: Bột th n c mật gấu đƣợc đặt trực tiếp trong túi vải (3 túi mỗi túi chứa 30 g và 1 túi chứa 15 g) rồi cho vào ống D để ễ ấ ra khỏi má . ƣu đặt vài vi n i thủ tinh ƣới đá ống D để tránh àm nghẹt ối ra vào của ống th ng nhau E. h ng đƣợc để ƣợng ột thân c trong ống D cao hơn vƣợt hơn mức cong của ống th ng nhau E.
R t ung m i đã ựa chọn (hexane, dichloromethane, chloroform, methanol) vào ình cầu ằng cách tháo hệ thống ở chỗ nút mài số (2), nhƣ thế ung m i sẽ thấm ƣớt ột c rồi mới chạ xuống ình cầu, ngang qua ngõ ống th ng nhau E. ƣu để thể t ch ƣợng ung m i trong ình cầu kh ng đƣợc nhiều hơn hai phần a thể t ch của ình cầu.
iểm tra hệ thống k n, mở cho nƣớc chả hoàn ƣu trong ống ngƣng hơi. Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt sao cho dung môi trong bình cầu sôi đều nhẹ. Dung môi tinh khiết khi đƣợc đun n ng sẽ bốc hơi n cao, theo ống B n cao hơn, rồi theo ống ngƣng hơi để n cao hơn nữa, nhƣng tại đ hơi dung môi bị ngƣng hơi àm ạnh, ngƣng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống ống D đang chứa bột thân cây. Dung môi ngấm vào bột thân cây và chiết
những chất hữu cơ nào c thể hòa tan vào dung môi. Theo quá trình đun n ng, ƣợng ung m i rơi vào ống D càng nhiều, mức dung môi dâng lên cao trong ống D và đồng thời cũng ng cao trong ống E, vì đ à ống th ng nhau. Đến một mức cao nhất trong ống E, dung môi sẽ bị hút về bình cầu A, lực hút này sẽ rút hết ƣợng ung m i đang chứa trong ống D.
Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển ung m i theo nhƣ mô tả úc đầu. Các hợp chất đƣợc hút xuống bình cầu và nằm lại tại đ , chỉ có dung môi tinh khiết à đƣợc bốc hơi a n để tiếp tục quá trình chiết. Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong bột thân cây. Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt má để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài (2), rút lấy một giọt dung môi và thử trên miếng kính, nếu thấy không còn vết gì tr n k nh à đã chiết kiệt.
Hình 2.6. Chiết bằng máy soxhlet
Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu , đuổi dung môi, thu đƣợc cao chiết. Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ bột thân cây đƣợc trữ lại trong bình cầu A, nên chúng luôn bị đun n ng ở nhiệt độ sôi của
dung môi vì thế nếu có hợp chất nào kém bền nhiệt thí dụ nhƣ carotenoi c thể bị ph n hủ .
Do toàn hệ thống của má đều bằng thủ tinh và đƣợc gia công thủ công nên giá thành một máy khá cao. Máy bằng thủy tinh nên dễ vỡ, trong đ các bộ phận của máy, nhất là các nút mài o đƣợc gia công thủ công nên chỉ cần àm vỡ một bộ phận nào đ thì kh tìm đƣợc một bộ phận khác có thể vừa khớp để thay thế.
Hình 2.7. Hệ thống 4 bộ soxhlet dùng để chiết bột thân cây mật gấu với các dung môi hexane, dichloromethane, chloroform, methanol
Hình 2.8. Cao chiết soxhlet với dung môi dichloromethane, hexane, methanol, chloroform
Ƣu điểm của kỹ thuật :
-Phƣơng pháp nà tiết kiệm đƣợc dung môi và hiệu quả tƣơng đối cao, không tốn công lọc và châm dung môi mới.
liệu luôn đƣợc ngấm và đƣợc chiết liên tục trong dung môi chiết.
Nhƣợc điểm của kĩ thuật: ch thƣớc của má soxh et àm giới hạn ƣợng ột thân c cần thiết. Má oại ớn nhất với ình cầu ung t ch 15 lít, c thể chứa một ần đến 10 t ung m i, ống D c thể chứa 800 gam ột thân c xa nhỏ. Với má nhỏ hơn, chỉ c thể cho vào mỗi ần vài tr m gam ột thân c , muốn chiết ƣợng ớn ột thân c cần phải ặp ại nhiều ần.
2.2.4. Phƣơng pháp phân lập phân đoạn từ tổng cao ethanol
a. Đ ều o et nol ằn p ươn p p n m ầm
* Nguyên tắc: Ngâm chất rắn (đã đƣợc nghiền nhỏ) vào dung môi thích
hợp trong thời gian xác định, sau đ gạn hoặc lọc lấy dung dịch rồi cô quay dung môi.
* Cách ti n hành: Cân 800 g mẫu thân cây mật gấu đã đƣợc nghiền nhỏ,
chiết bằng phƣơng pháp ng m với ethanol tuyệt đối ở nhiệt độ phòng (ngâm 3 lần, mỗi lần 3 ngày). Sau mỗi lần chiết đều trích mẫu đo UV - VIS. Dịch chiết đƣợc gộp lại và tiến hành cô quay chân không thu đƣợc 39.038 g cao ethanol.
(a) (b)
Hình 2.9. Bột thân cây mật gấu ngâm trong ethanol tuyệt đối (a) và cao tổng ethanol (b)
b. C t p n o et nol ằn un mô e ne dichloromethane, chloroform
* Nguyên tắ ơ ản c a chi t lỏng-lỏng: là sự phân bố của một chất
phân bố của một chất tan cho biết khả n ng hòa tan của chất nà đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằng, đƣợc biểu diễn bằng hằng số phân bố K:
K=Ca/Cb
Ca: nồng độ chất tan trong pha (a) tại giai đoạn cân bằng. Cb: nồng độ chất tan trong pha (b) tại giai đoạn cân bằng. Lựa chọn dung môi chiết [15]:
Dung môi chiết phải đảm bảo các yêu cầu sau: - Dung môi chiết phải hòa tan tốt chất đƣợc chiết.
- Không hòa lẫn với ung m i cũ, nghĩa à c tỉ khối khác nhiều với ung m i cũ.
- Dung m i nà kh ng đƣợc tƣơng tác với chất cần chiết và có nhiệt độ s i tƣơng đối thấp.
Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình chiết - Ảnh hƣởng của pH.
- Vai trò của sự tạo phức.
- Ảnh hƣởng của sự tạo thành hợp chất ít tan.
* Cách ti n hành: òa tan cao ethano với một ƣợng tối thiểu ethanol,
tiếp theo cho nƣớc cất vào đến 300 m và chia đều vào 3 bình tam giác, mỗi bình là 100 m . Sau đ tiến hành chiết ỏng - ỏng với các ung m i hexane, dichloromethane, chloroform.
Hình 2.10. Cao ethanol chiết phân bố bằng dung môi hexane, dichloromethane, chloroform
- Với hexane: Chiết 3 lần và mỗi lần là 200 ml hexane, thời gian lắc chiết mỗi lần là 4 giờ, thời gian tách lớp là 45 phút. Sau mỗi lần chiết đều trích mẫu đo UV - VIS. Gộp các dịch chiết rồi tiến hành c qua ch n kh ng, thu đƣợc 4.456 g cao hexane.
Hình 2.11. Dịch chiết hexane của 3 lần chiết
- Với chloroform: Chiết 6 lần và mỗi lần là 200 ml chloroform, thời gian lắc chiết mỗi lần là 4 giờ, thời gian tách lớp là 35 phút. Sau mỗi lần chiết đều trích mẫu đo UV - VIS. Gộp các dịch chiết rồi tiến hành cô quay chân không, thu đƣợc 1.323 g cao chloroform.
- Với dichloromethane: Chiết 7 lần và mỗi lần là 200 ml dichloromethane, thời gian lắc chiết mỗi lần là 4 giờ, thời gian tách lớp là 45 phút. Sau mỗi lần chiết đều trích mẫu đo UV - VIS. Gộp các dịch chiết rồi tiến hành cô quay ch n kh ng, thu đƣợc 4.344 g cao dichloromethane.
Trong điều kiện và thời gian thí nghiệm hạn chế, chúng tôi lựa chọn cao chiết ich oromethane để phân lập ph n đoạn.
Hình 2.13. Dịch chiết dichloromethane của 7 lần chiết
(a) (b) (c) Hình 2.14. Cao hexane (a), cao dichloromethane (b), cao chloroform
c. P n lập p n oạn ằn p ươn p p sắ ký * ắ ký ản mỏn 15], [31]
Phƣơng pháp nà đƣợc zmai op và Schrei er đề nghị từ n m 1938, đƣợc Stan phát triển, hoàn thiện n m 1955 và c ứng ụng rộng rãi.
- N u ên tắ : Phƣơng pháp sắc k ớp mỏng đƣợc ùng để định t nh,
thử tinh khiết và đ i khi để án định ƣợng hoặc định ƣợng hoạt chất thuốc. Sắc k ớp mỏng à một kỹ thuật tách các chất đƣợc tiến hành khi cho pha động i chu ển qua pha tĩnh tr n đ đã đặt hỗn hợp các chất cần tách. Pha tĩnh à chất hấp phụ đƣợc chọn phù hợp theo từng u cầu ph n t ch, đƣợc trải thành ớp mỏng đồng nhất và đƣợc cố định tr n các phiến k nh hoặc phiến kim oại. Pha động à một hệ ung m i đơn hoặc đa thành phần đƣợc trộn với nhau theo tỷ ệ qu định trong từng chu n uận. Trong quá trình i chu ển qua ớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử đƣợc i chu ển tr n ớp mỏng, theo hƣớng pha động, với những tốc độ khác nhau. ết quả, ta thu đƣợc một sắc k đồ tr n ớp mỏng. Cơ chế của sự chia tách c thể à cơ chế hấp phụ, ph n ố, trao đổi ion, sàng ọc ph n tử ha sự phối hợp đồng thời của nhiều cơ chế tù thuộc vào t nh chất của chất àm pha tĩnh và ung m i àm pha động.
Ðại ƣợng đặc trƣng cho mức độ i chu ển của chất ph n t ch à hệ số i chu ển Rf đƣợc t nh ằng tỷ ệ giữa khoảng ịch chu ển của chất thử và khoảng ịch chu ển của ung môi: Rf = a/ b
Trong đ :
a : Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến t m của vết mẫu.
b : Là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức ung m i đo tr n cùng đƣờng đi của vết, t nh ằng cm.
Rf: Chỉ có giá trị từ 0 đến 1.
thƣờng đƣợc ùng để định t nh và tách các hợp chất thi n nhi n. cũng đƣợc các nhà h a học tổng hợp sử ụng thƣờng xu n để nhanh ch ng ph n tách các chất thu đƣợc trong phản ứng.
hƣợc điểm của kỹ thuật: Thành phần pha động ễ tha đổi trong quá trình khai triển, các vết sau khai triển thƣờng ị kéo đu i và chỉ ùng khi hỗn hợp cần tách c số ƣợng t, vài tr m mi igam, còn nếu mẫu nhiều, vài gam thì tách ằng sắc k cột sẽ kinh tế hơn. - Chuẩn bị dụng cụ và thuốc thử