4. Những đóng góp mới của luận án
3.1Thiết kế hệ thống chỉnh sửa CRISPR/Cas9 nhằm gây tạo đột biến
GmGOLS trên đậu tương
Lựa chọn trình tự gen mã hóa Galactinol synthase (GmGOLS) và thiết kế cấu trúc chỉnh sửa hệ gen CRISPR/Cas9. Thông qua công cụ tìm kiếm BLAST, chúng tôi đã phân tích, kiểm tra mối quan hệ phát sinh loài giữa các GmGOLS đậu tương và các loài thực vật khác. Dựa trên trình tự protein Arabidopsis GOLS, 6 gen GmGOLS
giả định đã được xác định từ cơ sở dữ liệu hệ gen của đậu tương SoyBase.org (Hình 3.1).
Hình 3.1.Mối quan hệ phát sinh loài giữa các protein GOLS đã được xác định trong cây Arabidopsis, cà chua, ngô 23 trình tự protein GOLS
(đã được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài bằng phương pháp phân tích Neighbor Joining, sử dụng phần mềm MEGA X với 1000 lần lấy mẫu)
Đồng thời, tham khảo cơ sở dữ liệu về mức độ phiên mã của các gen GmGOLS
khác nhau trong các mô khác nhau và ở các giai đoạn phát triển khác nhau của hạt ở Hình 3.2, chúng tôi nhận thấy có sáu gen GmGOLS (Glyma.03G222000,
Glyma.19G219100, Glyma.03G229800, Glyma.20G094500, Glyma.10G145300, Glyma.19G227800) được nhóm lại cùng nhau tạo thành ba cặp tương đồng là
AtGOLS1, AtGOLS2 và AtGOLS3. Trong đó, biểu hiện của Glyma.03G222000
(GmGOLS03) tăng mạnh khi hạt chín và cho thấy mức độ biểu hiện ở hạt cao nhất trong số tất cả các gen GmGOLS [91]. Gen GmGOLS03 kích thước 2478 bp nằm trên chromosome 3 gồm 3 exon mã hóa cho đoạn polypeptide 339 axit amin.
Glyma.19G219100 (GmGOLS19) kích thước 2176 bp nằm trên chromosome 19 gồm 3 exon mã hóa cho đoạn polypeptide 339 axit amin. Bên cạnh đó, gen GmGOLS19
có mức độ biểu hiện tương đương với gen GmGOLS03 ở đầu giai đoạn phát triển của hạt (tức là cho đến giai đoạn R6) nhưng giảm xuống ở các giai đoạn phát triển sau. Các dữ liệu này chỉ ra rằng gen GmGOLS03 có khả năng là gen mã hóa chính cho enzyme galactinol synthase tham gia vào quá trình sinh tổng hợp RFOs trong quá trình phát triển hạt đậu tương. Do đó, trong nghiên cứu này, chúng tôi đã gây đột biến gen GmGOLS03 và gen tương đồng với gen GmGOLS03 là gen GmGOLS19 bằng hệ thống CRISPR/Cas9 để kiểm tra chức năng của GmGOLS trong quá trình sinh tổng hợp RFOs trong hạt đậu tương.
Hình 3.2. Phân tích transcriptomics cho GOLS trong đậu tương
Dữ liệu được lấy từ atekb.org
ưu tú của Việt Nam (ĐT26) và giống Mr làm vật liệu để gây đột biến có mục tiêu. Sử dụng trình tự bộ gen giống đối chứng Williams 82 và kết quả giải trình tự sơ bộ cho thấy các trình tự các gen GmGOLS03 và GmGOLS19 trong giống Mr và ĐT26 tương đồng 100% với các trình tự tương ứng trong bộ gen giống đối chứng William 82 [92].
Dựa trên các trình tự đã khai thác được trên hai giống vật liệu, hai trình tự RNA định hướng (sgRNAs) đã được chọn từ các vị trí đích tiềm năng trên
GmGOLS03 và GmGOLS19. Hai trình tự đích này giống nhau và nằm trong exon 2 của cả hai gen GmGOLS (Hình 3.3A và 3.3B)
Hình 3.3. Cấu trúc gen GmGOLS và vị trí của các trình tự gRNA
A. Trình tự sgRNA và PAM trên gen đích; B. Cấu trúc gen GmGOLS03, GmGOLS19, vị trí các gRNA và vị trí các cặp mồi sử dụng trong phân tích xác định
các đột biến.
Sau khi xác định được các sgRNA, trình tự mã hóa các sgRNA này được tổng hợp nhân tạo và ghép nối vào vector chuyển gen đã chứa trình tự mã hóa protein Cas9 để tạo thành cấu trúc chuyển gen hoàn chỉnh như Hình 3.4.
Hình 3.4. Sơ đồ minh họa cấu trúc vector chỉnh sửa gen CRISPR/Cas9 được thế kế