CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.3. xuất quy trình đánh giá độc học sinh thái bằng giun Quế
BẰNG GIUN QUẾ.
Quy trình đánh giá độc học sinh thái đối với các loài giun đất đã đƣợc hƣớng dẫn cụ thể trong các bản hƣớng dẫn của OECD. Tuy nhiên hƣớng dẫn này không hoàn toàn phù hợp với từng loại giun đất trong các điều kiện môi trƣờng và khí hậu khác nhau. Hơn nữa mỗi loài giun đất đều có một chế độ dinh dƣỡng và nhu cầu sinh thái khác nhau. Giun Quế là một loài giun phổ biến
30
tại Việt Nam, có phân bố rộng và thích nghi tốt với điều kiện môi trƣờng vùng nhiệt đới. Đây là một loài giun đất có sự nhạy cảm cao, sức chống chịu thấp, có thể sử dụng làm một sinh vật chỉ thị cho sức khỏe môi trƣờng đất. Do đó nghiên cứu này đề xuất quy trình đánh giá độc học sinh thái bằng giun Quế.
3.3.1. Nguyên lý quy trình.
Giun Quế trƣởng thành bị phơi nhiễm một loạt các nồng độ của chất thử nghiệm trong khoảng thời gian bốn tuần hoặc tám tuần tùy theo mục đích của nghiên cứu. Tỷ lệ tử vong và tỉ lệ tăng trƣởng của giun Quế trƣởng thành đƣợc xác định sau 4 tuần tiếp xúc. Sau đó những con giun trƣởng thành này đƣợc lấy ra khỏi môi trƣờng thí nghiệm, tiếp tục nuôi dƣỡng trong vòng bốn tuần kế tiếp để đếm số con non có ở trong đất nhằm đánh giá tỉ lệ sinh sản. Sản lƣợng sinh sản của giun tiếp xúc với các chất thử nghiệm đƣợc so sánh với các mẫu đối chứng.
3.3.2. Mô tả quy trình.
a. Nuôi và phân lập giun Quế.
Để có đƣợc những con giun đất đạt tiêu chuẩn về tuổi, khối lƣợng và không bị nhiễm hóa chất phải nuôi và phân lập từ trứng. Đặt giun đã trƣởng thành vào hộp nuôi dƣỡng chứa chất nền mới để sản xuất trứng và lấy chúng ra sau 20 ngày. Các con giun đất nở ra từ trứng đƣợc dùng cho phép thử khi đã trƣởng thành.
Môi trƣờng nuôi dƣỡng là hỗn hợp 50 : 50 phân bò tƣơi và than bùn. Môi trƣờng cần có pH khoảng từ 5 đên 7 (điều chỉnh bằng canxi cacbonat), độ ẩm khoảng 60%. Giun đƣợc nuôi trong thùng xốp có kích thƣớc 1×0,5×0,5m, nhiệt độ phòng ở khoảng 26 ± 3 oC, ở nhiệt độ này giun sẽ trƣởng thành sau 2 đến 3 tháng.
b. Chuẩn bị đất nhân tạo thử nghiệm.
Mỗi mẫu dùng một lƣợng chất nền là 500 g (khối lƣợng khô). Chất nền đƣợc gọi là "đất nhân tạo" có các thành phần nhƣ sau: 10% than bùn mịn, 10% phân bò khô, 30% đất sét Caolinit, 50% cát thạch anh công nghiệp (cát mịn là chủ yếu với trên 50% các hạt có kích thƣớc 0,05 mm đến 0,2 mm). Thêm một lƣợng đủ canxi cacbonat đã đƣợc nghiền nhỏ và có độ tinh khiết phân tích để
31
đƣa pH của chất nền đã đƣợc làm ẩm đến bằng 6,0 ± 0,5. Chất nền sẽ đƣợc làm ẩm bằng nƣớc đã đƣợc loại ion hoặc bằng nƣớc cất để đạt đƣợc 40 - 60% khả năng giữ nƣớc toàn phần của đất.
c. Lựa chọn giun cho thí nghiệm.
Nhóm 10 giun nên đƣợc cân ngẫu nhiên vào lúc bắt đầu của thử nghiệm. Những con giun đƣợc rửa sạch trƣớc khi cân (bằng nƣớc khử ion) và làm khô bằng cách đặt giun một thời gian ngắn trên giấy lọc.
Giun đƣợc lựa chọn nên đƣợc thích nghi cho ít nhất một ngày với các loại chất nền nhân tạo đƣợc sử dụng để thử nghiệm.
Khi cho giun vào chất nền, sau 15 phút những con giun còn trên bề mặt sẽ đƣợc thay thế bằng những con có kích thƣớc tƣơng tự.
d. Pha trộn chất thử nghiệm vào đất nhân tạo.
Trong quá trình xác định nồng độ, nên đƣợc lƣu ý những điều sau đây: - Đối với xác định NOEC, ít nhất năm - mƣời hai dãy nồng độ, bốn lần lặp lại cho mỗi dãy nồng độ thử nghiệm cộng với tám mẫu đối chứng. Nồng độ nên đƣợc đặt cách nhau không vƣợt quá 2,0.
- Đối với xác định ECX (ví dụ EC10, EC50), ít nhất hai lần nhắc lại cho mỗi nồng độ thử nghiệm và sáu mẫu đối chứng. Các yếu tố khoảng cách có thể thay đổi, nghĩa là nhỏ hơn hoặc bằng 1,8 trong phạm vi kết quả dự kiến và trên 1,8 ở nồng độ cao hơn và thấp hơn.
- Đối với xác định cả NOEC và EC nên sử dụng 8 dãy nồng độ, bốn lần lặp lại cho mỗi dãy, cộng với tám mẫu. Dãy nồng độ nên đƣợc chọn cách nhau không quá 1,8.
Chất thử nghiệm đƣợc trộn vào đất thông qua các hình thức trộn trực tiếp, phun lên bề mặt. Nếu chất thử nghiệm là chất rắn không tan trong nƣớc thì có thể nghiền nhỏ và trộn trực tiếp vào đất. Trƣờng hợp chất thử nghiệm tan trong nƣớc thì cần chú ý lƣợng nƣớc bổ sung sao cho phải giữ đƣợc độ ẩm ở mức độ cho phép.
Trong quá trình cho hóa chất vào các lô thí nghiệm cần chú ý không cho hóa chất tiếp xúc trực tiếp với giun.
32
e. Quá trình chăm sóc và đánh giá.
Thức ăn cho giun có nhiều loại khác nhau nhƣng nên sử dụng phân bò, hoặc phân ngựa sẽ đạt đƣợc hiệu quả cao nhất. Theo nhƣ hƣớng dẫn của OECD chỉ cho 5 g phân bò tƣơi vào mỗi lần cho ăn, tuy nhiên thực tế cho thấy lƣợng thức ăn này không đủ để 10 con giun có thể phát triển đƣợc. Do đó nên tăng lên thành 50 g phân bò tƣơi và 5 ml nƣớc cất đƣợc trải đều trên bề mặt vào ngày đầu tiên, sau đó thức ăn đƣợc cung cấp một lần một tuần trong suốt giai đoạn 4 tuần đầu thử nghiệm.
Đến ngày thứ 28 những con giun trƣởng thành đƣợc lấy ra khỏi thí nghiệm, tiếp tục cho 50 g thức ăn vào mỗi mẫu và không cho ăn vào 4 tuần còn lại của thí nghiêm. Tuy nhiên giai đoạn này cần kiểm tra độ ẩm và nhiệt độ để cung cấp đủ điều kiện cho trứng có thể nở.
Vào cuối của khoảng thời gian 4 tuần thứ hai, số lƣợng con non nở từ kén trong số đất kiểm tra. Tất cả các dấu hiệu tổn hại hoặc thiệt hại đến giun cũng cần đƣợc ghi nhận trong suốt thời gian thử nghiệm.
d. Dữ liệu và báo cáo.
Sinh vật thử nghiệm
- Động vật thử nghiệm đƣợc sử dụng: loài, tên khoa học, nguồn gốc của sinh vật và điều kiện chăn nuôi;
- Độ tuổi, kích thƣớc (khối lƣợng) phạm vi của các sinh vật thử nghiệm. Điều kiện thử nghiệm
- Đất thử nghiệm;
- Mô tả các thiết kế thí nghiệm và quy trình;
- Kích thƣớc của mẫu thử nghiệm và khối lƣợng đất thử nghiệm;
- Điều kiện thử nghiệm: cƣờng độ ánh sáng, thời gian của chu kỳ ánh sáng-tối, nhiệt độ;
- Mô tả các chế độ cho ăn, các loại và số lƣợng thực phẩm đƣợc sử dụng trong các thử nghiệm, ngày cho ăn;
33
- PH và hàm lƣợng nƣớc trong đất ở đầu và cuối của bài thử nghiệm. Kết quả thử nghiệm
- Tỷ lệ tử vong của giun trƣởng thành (%) trong mỗi mẫu vào cuối 4 tuần đầu tiên của thử nghiệm;
- Tổng khối lƣợng đầu vào của giun trƣởng thành từng mẫu thử nghiệm; - Thay đổi trọng lƣợng cơ thể của giun trƣởng thành (% trọng lƣợng ban đầu) trong mỗi mẫu sau bốn tuần đầu tiên của thử nghiệm;
- Số lƣợng con non trong từng mẫu vào cuối của thử nghiệm;
- Mô tả các triệu chứng rõ ràng hoặc bệnh lý hoặc thay đổi rõ rệt trong hành vi;
- Kết quả thu đƣợc với các chất thử nghiệm tài liệu tham khảo; - Xác định LC50, NOEC và / hoặc ECX (ví dụ nhƣ EC50, EC10). - Sơ đồ tƣơng quan.
34