6. Bốc ục đề tài
2.3.4. Phương pháp chiết mẫu thực vật
a. Giới thiệu chung
- Nguyên tắc và cơ sở của sự chiết
Chiết dựa trên cơ sở sự hòa tan (hay phân bố) khác nhau của chất phân tích vào trong hai dung môi không trộn lẫn vào nhau. Tức là chất phân tích tan tốt trong dung môi này những không tan tốt trong dung môi kia, nghĩa là sự phân bố của chất trong hai dung môi là khác nhau, nhờ đó mà lấy được chất phân tích ra khỏi mẫu ban đầu, chuyển nó vào dung môi mong muốn, sau đó xác định nó trong dung môi vừa chiết được. Như vậy, yếu tố quyết định sự tách và xử lý mẫu là hệ số phân bố của chất phân tích trong các pha và điều kiện thực hiện chiết tách [6].
Hệ số phân bố là một hằng số vật lý (hằng số nhiệt động) đặc trưng cho sự chiết. Nó cho biết sự phân bố (hay hòa tan) của các chất phân tích trong hai dung môi (hay 2 pha) không trộn lẫn vào nhau theo tỷ lệ hay mức độ nào. Nếu giá trị hằng số này càng lớn thì sự phân bố đó càng khác nhau nhiều, càng thuận lợi cho sự chiết tách các chất. Nếu chất X được phân bố vào hai dung môi không trộn lẫn vào nhau (A và B) thì hệ số phân bố này được xác định theo biểu thức sau:
KD = (1.2) Trong đó: CX(A) và CX(B) là nồng độ chất X trong hai dung môi A và B. Nếu hệ số phân bố KD > 99/1 xem như chất X chuyển hoàn toàn vào dung môi A. Đây là điều kiện của quá trình chiết lấy chất phân tích ra khỏi mẫu.
- Các điều kiện của sự chiết
Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đạt được các yêu cầu sau đây:
·Dung môi chiết phải có độ tinh khiết cao, đảm bảo không làm nhiễm bẩn chất phân tích.
·Dung môi chiết phải hòa tan tốt chất phân tích, nhưng không hòa tan tốt các chất có trong mẫu.
·Hệ số phân bố chiết phải lớn để sự chiết được triệt để.
·Cân bằng chiết nhanh đạt, có tính thuận nghịch để giải chiết được tốt. ·Sự phân lớp khi chiết phải rõ ràng, nhanh và dễ tách ra riêng biệt. ·Phải chọn pH hay môi trường axit thích hợp.
·Chọn nhiệt độ phù hợp.
·Phải thực hiện lắc mạnh trong quá trình chiết.
b. Phương pháp chiết soxhlet
- Nguyên tắc
Chiết soxhlet là kỹ thuật chiết đặc biệt được thực hiện nhờ loại thiết bị riêng. Kiểu chiết này cũng như chiết lỏng - lỏng. Bản chất của sự chiết là định luật phân bố của một chất trong hai pha không trộn lẫn vào nhau. Pha mẫu có thể ở trạng thái lỏng, bột, dạng mảnh hay lá. Dung môi chiết (hữu cơ) ở trạng thái lỏng. Vì thế đây là kiểu chiết của hệ có thể đồng thể hoặc dị thể. Trong thực tế, hệ dị thể là phổ biến và chất phân tích năm trong matrix rắn.
- Dụng cụ
Gồm 01 bình cầu đặt trong bếp đun có thể điều chỉnh nhiệt độ. Một bộ phần chứa mẫu, gồm 3 ống: ống có đường kính lớn, ở giữa để chứa mẫu; ống có đường kính trung bình để dẫn dung môi từ bình cầu bay lên đi qua ống chứa mẫu; ống có đường kính nhỏ, là ống thông nhau để dẫn dung môi từ ống chứa mẫu trả lại bình cầu. Trên cao là ống để ngưng hơi.
- Cách tiến hành
Bột dược liệu sau khi rửa sạch, xắt lát, giã, xay thô đựng trong một cái túi vải (để dễ lấy ra khỏi máy) được đặt trực tiếp trong ống chưa dược liệu. Lưu ý đặt vài viên bi thủy tinh dưới đáy ống chứa dược liệu để tránh làm ngẹt lối ra vào của ống thông nhau. Không được để lượng dược liệu trong ống dược liệu cao vượt hơn mức cong của ống thông nhau. Rót dung môi đã lựa chọn vào bình cầu bằng cách tháo hệ thống ở nút mài, như thế dung môi sẽ thấm ướt bột cây rồi mới chạy xuống bình cầu, ngang qua ngõ ống thông nhau. Lưu ý để thể tích lượng dung môi trong bình cầu không được nhiều hơn hai phần ba thể tích của bình cầu.
Kiểm tra hệ thống kín, mở cho nước chảy hoàn lưu trong ống sinh hàn. Cắm bếp điện và điều chỉnh nhiệt sao cho dung môi trong bình cầu sôi nhẹ đều. Dung môi tinh khiết khi được đun nóng sẽ bốc hơi lên cao, theo ống dẫn dung môi lên cao hơn, rồi theo ống sinh hàn để lên cao hơn nữa, nhưng tại đây hơi dung môi bịống sinh hàn làm lạnh, ngưng tụ thành thể lỏng, rớt thẳng xuống ống chứa dược liệu. Dung môi ngấm vào dược liệu và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi. Theo quá trình đun nóng, lượng dung môi rơi vào ống chứa dược liệu càng nhiều, mức dung môi dâng lên cao trong ống và đồng thời cũng dâng cao trong ống thông, vì đây là ống thông nhau. Đến một mức cao nhất trong ống thông, dung môi sẽ bị hút vào bình cầu, lực hút này sẽ rút lượng dung môi chứa trong ống chứa dược liệu.
Bếp vẫn tiếp tục đun và một quy trình mới vận chuyển dung môi theo như mô tả lúc đầu. Các hợp chất được rút xuống bình cầu và nằm lại tại đó, chỉ có dung môi tinh khiết là được bốc hơi bay lên để tiếp tục quá trình chiết. Tiếp tục đến khi chiết kiệt chất trong dược liệu (dung môi eter dầu hỏa chỉ chiết kiệt những chất kém phân cực nào có thể tan được trong eter dầu hỏa nóng).
Kiểm tra sự chiết kiệt bằng cách tắt máy để nguội và mở hệ thống chỗ nút mài, rút lấy một giọt và thử trên mặt kiếng, nếu thấy không có vết gì trên kiếng là đã chiết kiệt. Sau khi hoàn tất, lấy dung môi chiết ra khỏi bình cầu, đuổi dung môi và thu được cao chiết
-Một số lưu ý
Các hợp chất chiết được trữ trong bình cầu, đến một lúc nào đó nồng độ của chất đạt đến mức bão hòa thì cần phải thay dung môi mới.
Tùy trường hợp, việc chiết có thể kéo dài trong vài ngày. Muốn nghỉ, cần phải tắt bếp điện trước, chờ thêm khoảng 30 phút mới tắt ống nước làm lạnh ống sinh hàn.
Khi thực hiện sự chiết với dung môi có nhiệt độ sôi thấp, phòng thí nghiệm ở xứ nóng, cần lưu ý xem ống sinh hàn có đủ sức làm ngưng tụ hơi hay không, nếu không, sẽ thấy khí bốc ra khỏi hệ thống từ đầu trên cao của ống sinh hàn, trong trường hợp đó cần tìm cách nối dài thêm ống sinh hàn. Lưu ý đây là hệ thống hở, phần bên trong của hệ thống thông với không khí bên ngoài nhờ ống sinh hàn, vì thế khi nối dài ống sinh hàn không được làm ống bị bít.
Sau khi chiết kiệt với một loại dung môi, ví dụ với eter dầu hỏa, muốn tiếp tục chiết với một dung môi có tính phân cực cao hơn chẳng hạn clorofom thì ta phải rút bao chứa bột cây ra khỏi ống, mở miệng bao cho dung môi bay hết, rồi cho bao trở lại ống, rót dung môi mới là clorofom vào, bắt đầu quy trình chiết mới.
- Ưu điểm và nhược điểm
· Ưu điểm:
Tiết kiệm dung môi, chỉ một lượng ít dung môi mà chiết kiệt được mẫu nguyên liệu. Không phải tốn công lọc và châm dung môi mới.
Không tốn các thao tác lọc và châm dung môi mới như các kỹ thuật khác. Chỉ cần cắm điện, mở nước hoàn lưu là máy sẽ thực hiện sự chiết.
Chiết kiệt hợp chất trong bột cây vì bột cây luôn được liên tục chiết bằng dung môi tinh khiết.
· Nhược điểm:
Kích thước của máy Soxhlet làm giới hạn lượng bột nguyên liệu cần chiết. Muốn chiết lượng lớn bột nguyên liệu cần phải lặp lại nhiều lần.
Trong quá trình chiết, các hợp chất chiết ra từ bột cây được trữ lại trong bình cầu, nên chúng luôn bị đun nóng ở nhiệt độ sôi của dung môi vì thế nếu có hợp chất nào kém bền nhiệt ví dụ như carotenoid có thể bị hư hại.
Do toàn bộ hệ thống của máy đều bằng thủy tinh và được gia công thủ công nên giá thành một máy khá cao. Thiết bị bằng thủy tinh nên dễ vỡ, trong đó các bộ phận của máy, nhất là các nút mài do được gia công thủ công nên chỉ cần làm bể một bộ phận nào đó thì khó tìm được một bộ phận khác vừa khớp để thay thế.