PHẦN 3 ĐỐI TƯỢNG, VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5 Phương pháp nghiên cứu
3.5.2. Phương pháp phân lập, xác định vi khuẩn trên các bệnh nhân điều trị tạ
trị tại Bệnh viện Trung Ương thái nguyên từ tháng 01/2021 – 05/2021
3.5.2.1. Kỹ thuật lấy bệnh phẩm
Bệnh phẩm có thể chuyển đến từ các khoa phịng nội trú tại bệnh viện hoặc là bệnh nhân trực tiếp tới khoa để lấy bệnh phẩm. Bệnh phẩm phải đảm bảo tính vơ khuẩn, vị trí lấy bệnh phẩm phải chuẩn xác và đúng thời gian.
Các bệnh phẩm như là phân, đờm hay nước tiểu có thể lấy bằng tăm bông vô khuẩn và đựng trong lọ chứa bệnh phẩm vô trùng. Đối với nước tiểu phải đảm bảo thể tích lớn hơn 0,5ml.
Đối với bệnh phẩm là mủ được chuyển từ các phòng khoa của bệnh viện mang đến nên được lấy bằng bơm tiêm vơ trùng và vận chuyển nhanh chóng tới khoa để nuôi cấy..
- Đối với bệnh phẩm là máu thì có các chai cấy máu co chứa môi trường dinh dưỡng để vi khuẩn trong máu sống lấy 3 – 5 ml máu bệnh nhân bơm vào trong chai.
3.5.2.2. Quan sát trực tiếp bằng kính hiển vi
Khi quan sát bằng kính hiển vi ta nhìn thấy hình dạng và khả năng bắt màu của vi. Để quan sát được vi khuẩn ta sẽ làm vi khuẩn trên tiêu bản để quan sát. Đối với vi khuẩn dễ quan sát dễ định danh ta có thể làm tiêu bản soi tươi để phát hiện khả năng di động của vi khuẩn, sự có mặt của nấm, trùng roi gây bênh hoặc chúng ta nhuộm tiêu bản để xem hình thái của vi khuẩn.
- Soi tươi: Để phát hiện khả năng di động của vi khuẩn
Tiêu bản giọt ép: Đối với bệnh phẩm lỏng hay canh khuẩn ta dùng que cấy hoặc ống hút lấy bệnh phẩm nhỏ 1-2 giọt lên lam kính. Đối với bệnh phẩm đặc ta nhỏ trước 1 giọt NaCl 0,9% ô khuẩn lên lam kính rồi dùng que cấy hịa đều bệnh phẩm và giot NaCl chúng ta vừa nhỏ.
Đặt lá kính lên vùng bệnh phẩm tránh tạo bọt và tràn ra ngồi Soi kính hiển vi với vật kính X10, vật kính X40.
- Nhuộm:
Làm tiêu bản bằng cách dùng que cây vô trùng lấy bệnh phẩm rồi dàn đều trên vùng giữa của tiêu bản rồi để khô.
Kỹ thuật nhuộm Gram Theo Hucker cải tiến Tiến hành:
Nhỏ dung dịch tím Gentain lên vùng bệnh phẩm để trong 1 phút sau đó ta rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ.
Tiếp tục nhỏ dung dich lugol để trong 30 giây. Đổ dung dịch lugol rồi rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ.
Tẩy màu bằng cách nhỏ còn 90o lên tiêu bản tay cầm tiêu bản nghiêng di nghiêng lại để cho cồn chảy từ cạnh nọ sang cạnh kia. Khi màu tím ở trên lam kính vừa phải thì rửa ngay để loại bỏ cồn.
Cuối cùng ta nhỏ dung dịch đỏ fuchsin hoặc safranin lên tiêu bản để trong 30 giây, rồi rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy nhẹ
Để khơ tiêu bản, nhỏ dầu soi và soi kính hiển vi với vật kính dầu X100. Quan sát nếu các vi khuẩn bắt màu tìm thì đó là vi khuẩn Gram (+), các vi khuẩn bắt màu đỏ là Gram (-)[12].
3.5.2.3. Nuôi cấy vi khuẩn theo phương pháp của Robert Koch, 1881
Phương pháp phổ biến và quan trọng để phân lập vi khuẩn bằng phương pháp vi sinh.
+ Các loại vi khuẩn khác nhau sống trên các mơi trường khác nhau. Có thể là mơi trường lỏng hoặc đặc hoặc bán rắn hay mơi trường bình thường là mơi trường nước thịt, thạch thường hoặc môi trường đặc biệt (môi trường gelatin, môi trường thạch máu, mơi trường óc yếm khí, mơi trường khoai tây…)
+ Ni cấy vi khuẩn trong môi trường lỏng:Ta dùng que cấy lấy vô trùng lấy bệnh phẩm và nhẹ nhàng đưa chúng vào môi trường lỏng để nuôi cấy. Đem ủ ở nhiệt dộ thích hợp 370C trong 18 - 24 giờ. Vi khuẩn có thể phát triển làm đục môi trường hoặc tạo váng trên bề mặt nước.
+ Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường đặc: Áp dụng nhiều nhất là môi trường thạch dinh dưỡng các vi khuẩn được nuôi cấy sẽ mọc các khuẩn lạc trên bề mặt thạch dinh dưỡng mà có thể quan sát bằng mắt thường. Dựa vào màu sắc, hình thái, kích thước khuẩn lạc có thể giúp định danh sơ bộ về vi khuẩn đó. Pha mơi trường có bổ sung 8 – 12 % agar đổ ra ống thạch nghiêng
hoặc đĩa peptri hút dịch vi khuẩn lên bề mặt thạch cấy trải đều. Để vào tủ ấm 370C quan sát sự mọc của khuẩn lạc[9].
3.5.2.4. Xác định vi khuẩn
Khảo sát những tính chất sinh hóa
- Giám định vi khuẩn bằng môi trường đường: Các loại đường như glucose, lactose, mantose… Chia vào ống nghiệm, khử trùng, cấy vi khuẩn lên và quan sát tùy từng loại vi khuẩn có khả năng mọc thành màu khác nhau ở mơi trường có đường và chỉ thị khác nhau. Có các mơi trường như KIA chứa đường lactose, glucose, môi trường manit chứa đường mantose,…. Cấy vi khuẩn vào môi trường để tủ ấm 37oC qua đêm, quan sát màu sắc của thạch.
- Giám định vi khuẩn bằng phản ứng VP (Voges-Proskauer) : cấy vi khuẩn vào môi trường lỏng như clack-bus để tủ ấm 37oC từ 2 - 4 ngày sau đó nhỏ dung dịch thử vào nếu màu đỏ hồng là dương tính[9].
3.5.2.5. Ngưng kết với kháng nguyên đặc hiệu
- Ngưng kết chủ động: kháng nguyên nằm trên bề mặt tế bào vi khuẩn, trong vi khuẩn với kháng thể tương ứng sẽ có hiện tượng ngưng kết.
- Ngưng kết thụ động: Kháng nguyên hòa tan hoặc kháng thể được gắn trên nền mượn (hồng cầu, hạt chất dẻo hoặc tế bào vi khuẩn) khi gặp kháng thể hoặc kháng nguyên tương ứng thì sẽ xảy ra hiện tượng ngưng kết.
- Ngưng kết kháng nguyên là phương pháp ít sử dụng với các vi khuẩn khác nhau thì có phương pháp khác nhau để xác định đối với các trường hợp mà nuôi cấy, chạy đường mà khơng cho kết quả mong muốn, cịn nghi ngờ thì sẽ ngưng kết. Ví dụ: vi khuẩn đường ruột để kiểm tra có phải là Samonella thì sử dụng ngưng kết kháng nguyên.
3.5.2.6. Phương pháp bảo quản mẫu
Sau khi phân lập, xác định vi khuẩn và làm kháng sinh đồ tìm được một chủng thuần nhất thường sẽ giữ chủng để kiểm tra lại hoặc phục vụ cho
nghiên cứu sau đó. Ở bệnh viện thường sử dụng phương pháp lạnh động bảo quản trong tủ âm sâu ở -80oC.
- Chuẩn bị tế bào cho lạnh sâu: Tế bào được nuôi cấy trên mơi trường và nhiệt độ thích hợp nhất tại giữa hoặc đầu pha log.
- Pha dịch tế bào với glycerol đã thanh trùng trước để đạt nồng độ cuối cùng 10% và mật độ tế bào 106/ml
- Dịch huyền phù tế bào được đưa vào ống lạnh sâu và đóng nắp (trong trường hợp hàn ống thuỷ tinh, cần để trong dịch xanh metylene 0.05% để phát hiện các ống bị rị rỉ).
- Tồn bộ mẫu để ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để cho cân bằng áp suất thẩm thấu trong và ngồi tế bào. Trong trường hợp có nitơ lỏng thì mẫu được chuyển sang bình nitơ lỏng.
- Mẫu đưa vào lạnh sâu cũng cần theo tốc độ nhất định. Thông thường tốc độ lạnh dao động 1-3oC/phút để đạt tới nhiệt độ -30oC ban đầu. Sau đó mẫu được làm lạnh tiếp với tốc độ cao hơn 10-15oC/phút để đạt tới nhiệt độ lạnh -80oC.
- Hoạt hoá mẫu: Mẫu trong lạnh (lạnh sâu hay nitơ lỏng) được hoạt hoá bằng cách làm tan nhanh tới mức có thể (thơng thường đưa ngay vào tủ ấm 37oC trong 40-60 giây). Như vậy, theo cách trên có thể đạt được khả năng sống 95% tế bào sau 10 năm bảo quản [9].