SỰ SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN E.COLI W- 123docz.net

4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

3.1. SỰ SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA VI KHUẨN E.COLI WT VÀ

VÀ E.COLI BL21/PBAD3014MANB THEO THỜI GIAN

Sự sinh trƣởng và phát triển của vi khuẩn E.coli WT và E.coli

BL21/pBAD3014ManB đƣợc thể hiện qua đƣờng cong sinh trƣởng và tốc độ tăng trƣởng. Kết quả đƣợc trình bày ở Hình 3.1 và Hình 3.2.

Kết quả cho thấy rằng E.coli WT và E.coli BL21/pBAD3014 ManB có pha tiềm phát kéo dài khoảng 2 giờ. Pha lũy thừa của E.coli BL21/pBAD3014ManB kéo dài từ 2 đến 6 giờ, tƣơng ứng với tốc độ tăng trƣởng cực đại đạt là 0,03 ở thời điểm sau 6 giờ nuôi cấy. Đối với E.coli WT pha lũy thừa chỉ kéo dài từ 2 giờ đến 4 giờ, tốc độ tăng trƣởng cực đại đạt là 0,04 ở thời điểm sau 4 giờ nuôi cấy, thấp hơn 1,3 lần so với E.coli

BL21/pBAD3014ManB. Sau pha tăng trƣởng, tế bào vi khuẩn sinh trƣởng chậm hơn và đi vào pha cân bằng.

Hình 3.1. Đƣờng cong sinh trƣởng của E.coli WT và E.coli BL21/pBAD3014ManB.

Hình 3.2. Tốc độ tăng trƣởng của E.coli WT và E.coli BL21/pBAD3014ManB. 8 8.5 9 9.5 10 10.511 11.512 12.513 13.5 0 2 4 6 8 101214161820222426283032343638 E.coli WT E.coli BL21/pBAD3014ManB

Thời gian (giờ)

L og ( C F U /m l) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0 2 4 6 8 10121416182022242628303234363840 T ốc đ ộ tă ng tr ƣ ởn g

Thời gian (giờ)

E.coli WT E.coli

Từ kết quả hình 3.1 và hình 3.2 cho thấy việc biến nạp gen không ảnh hƣởng đến tốc độ sinh trƣởng và phát triển của E.coli BL21/pBAD3014ManB mà ngƣợc lại E.coli

BL21/pBAD3014ManB còn có tốc độ tăng trƣởng mạnh hơn E.coli WT.

3.2. ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI ĐIỂM BỔ SUNG CHẤT CẢM ỨNG ĐẾN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MANNANASE

Thời điểm bổ sung chất cảm ứng có ý nghĩa quan trọng trong việc biểu hiện enzyme. Kết quả của đƣờng cong sinh trƣởng là cơ sở để thiết kế thời điểm bổ sung chất cảm ứng sao cho thời điểm bổ sung phải nằm trong pha lũy thừa. Thời điểm thích hợp để bổ sung chất cảm ứng là khi giá trị OD600nm của canh trƣờngđạt từ 0,2 đến 1,3. Kết quả hoạt độ enzyme tại các thời điểm bổ sung chất cảm ứng khác nhau thể hiện ở Bảng 3.1 và Hình 3.3.

Bảng 3.1. Hoạt độ enzyme tại các thời điểm bổ sung chất cảm ứng.

Thời điểm bổ sung chất cảm ứng Hoạt độ enzyme (U/ml)

OD600nm=0,3 13,1305±0,73ab

OD600nm=0,6 14,0825±0,18a

OD600nm=0,9 12,7702±0,51b

OD600nm=1,2 10,2486±0,87c

(Số liệu trong bảng là trung bình của 3 lần lặp lại. Các chữ số khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định Duncan ở độ tin cậy 95%).

Ở các thời điểm bổ sung chất cảm ứng khác nhau thì hoạt độ enzyme có sự khác biệt có ý nghĩa. Thời điểm bổ sung chất cảm ứng OD600nm= 0,6 cho kết quả hoạt độ enzyme cao nhất đạt giá trị 14,08 U/ml, hoạt độ enzyme thấp nhất (10,2486 U/ml) thu nhận đƣợc từ mẫu thí nghiệm lựa chọn thời điểm bổ sung chất cảm ứng OD600nm= 1,2. Ngoài ra, có thể thấy rằng, thời điểm bổ sung chất cảm ứng tại OD600nm = 0, 3 và OD600nm = 0,9 cũng cho kết quả hoạt độ enzyme cao, tƣơng ứng lần lƣợt là 13,1305 U/ml và 12,7702 U/ml. Điều này có thể giải thích đƣợc rằng, các giá trị OD đã đƣợc chọn nằm trong pha lũy thừa

(OD600nm có giá trị từ 0,2 đến 1,3) là thời điểm các tế bào sinh trƣởng mạnh, giá trị

OD600nm= 0,6 giá trị OD tại trung tâm của pha lũy thừa nên tại đó tế bào sinh trƣởng mạnh

nhất nên sẽ cho hoạt độ enzyme cao nhất, OD600nm= 1,2 nằm gần cuối pha lũy thừa nên tốc độ tăng trƣởng giảm dần do đó hoạt độ enzyme thấp hơn. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả đƣờng cong sinh trƣởng của E.coli BL21/pBAD3014ManB.

Đối với biểu hiện các loại protein tái tổ hợp khác nhau trên E.coli BL21 thì thời điểm thích hợp bổ sung chất cảm ứng là khác nhau. Trịnh Thị Hà và cs (2018) khi nghiên cứu biểu hiện của ChitA tái tổ hợp cho thấy thời gian bổ sung chất cảm ứng tối ƣu nhất tại giá trị mật độ OD600nm=0,7 và khoảng thời gian thích hợp bổ sung khi OD600nm đạt giá trị từ 0,6 đến 1,0.

3.3. ẢNH HƢỞNG CỦA NỒNG ĐỘ CHẤT CẢM ỨNG ĐẾN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MANNANASE

Sau khi lựa chọn thời điểm bổ sung chất cảm ứng tại OD600nm= 0,6, tiến hành thực hiện khảo sát sự ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng L-arabinose. Kết quả hoạt độ enzyme đƣợc thể hiện ở Bảng 3.2 và Hình 3.4.

Bảng 3.2. Hoạt độ enzyme ở các nồng độ cảm ứng. Nồng độ chất cảm

ứng(mg/ml) Hoạt độ enzyme (U/ml)

0 12,3581±0,33d 0,5 13,1790±1,08bc 0,7 13,5715±0,002abc 0,9 14,7882±0,92a 1,1 13,9875±0,39ab 1,3 13,8358±0,1abc

(Số liệu trong bảng là trung bình của 2 lần lặp lại. Các chữ số khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định Duncan ở độ tin cậy 95%).

Hình 3.4. Ảnh hƣởng của nồng độ chất cảm ứng đến hoạt độ enzyme.

Từ kết quả Bảng 3.2 và Hình 3.4 cho thấy, khi tăng nồng độ L-arabinose từ 0,5mg/ml đến 0,9mg/ml thì hoạt độ enzyme tăng lên tƣơng ứng lần lƣợt là 13,1790 U/ml và 14,7882 U/ml. Hoạt độ enzyme bắt đầu giảm nếu tăng nồng độ L-arbinose lên đến 1,3mg/ml (13,8358 U/ml). Hoạt độ enzyme đạt giá trị cao nhất tại nồng độ L-arobinose là 0,9mg/ml (14,7882 U/ml).

3.4. ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI ĐIỂM THU TẾ BÀO ĐẾN SỰ BIỂU HIỆN CỦA MANNANASE CỦA MANNANASE

Thời gian lên men là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sự biểu hiện của protein tái tổ hợp mannanase, vì lƣợng protein đƣợc tổng hợp ở các thời điểm là khác nhau. Nếu thu sớm thì protein chƣa tổng hợp đƣợc tối đa, nếu thu muộn thì sinh ra các chất ức chế và phân hủy protein mới đƣợc tạo thành. Vì khi môi trƣờng thiếu dinh dƣỡng, tế bào sẽ tiết ra protease để thủy phân, chuyển hóa các tế bào chết và các sản phẩm phụ thành nguồn dinh dƣỡng cho tế bào, do đó các sản phẩm protein tái tổ hợp thƣờng bị thủy phân bởi protease (Shojaosadati và cs, 2008). Do đó, tiến hành khảo sát thời gian thu nhận tế bào để chọn thời điểm thu đƣợc hoạt độ enzyme là cao nhất. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3 và Hình 3.5.

Bảng 3.3. Hoạt độ enzyme tại các thời điểm thu tế bào.

Thời điểm thu tế bào (giờ) Hoạt độ enzyme (U/ml)

2 14,9805±0,15bc

4 15,1333±0,16bc

6 15,2916±0,25ab

8 15,6992±0,32a

24 14,6114±0,03c

Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thời gian thu tế bào đến hoạt độ enzyme.

Kết quả ở hình 3.5 cho thấy, sau 2 giờ bổ sung chất cảm ứng hoạt độ của mannanase tái tổ hợp bắt đầu tăng, đến 8 giờ thì đạt cực đại (15,6992 U/ml), sau đó bắt đầu giảm đến 24 giờ thì hoạt độ còn 14,6114 U/ml. Kết quả này cho thấy khoảng thời gian thích hợp cho quá trình thu tế bào để thu nhận enzyme đạt đƣợc hoạt độ cao là từ 2 đến 8 giờ. Theo một nghiên cứu khác của Trịnh Thị Hà và cs (2018) khi nghiên cứu biểu hiện của ChiA tái tổ hợp trong hệ thống biểu hiện E.coli BL21 cho thấy sau 3 giờ bổ sung chất cảm ứng thì hoạt tính enzyme của chitinase tái tổ hợp mới bắt đầu tăng và đạt cực đại sau 9 giờ. Nhƣ vậy, trên cùng một hệ thống biểu hiện là E.coli BL21 thì thời gian để thu nhận các loại protein tái tổ hợp khác nhau là khác nhau.

Do đó lựa chọn thời giancho việc thu tế bào để sinh mannanase tối ƣu nhất là sau 8 giờ từ lúc bổ sung chất cảm ứng.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.KẾT LUẬN

Trên cơ sở kết quả thu đƣợc và tổng hợp từ những dữ liệu đƣa ra đƣợc những kết luận sau:

- Sau khi biến nạp vecto pBAD3014ManB vào E.coli BL21 không làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của tế bào.

-Hoạt độ mannanase đạt giá trị cao nhất 15,6992 U/ml khi tiến hành lên men vi sinh vật E.coli BL21/pBAD3014ManB trong môi trƣờng LB có bổ sung chất cảm ứng L- arabinose với nồng độ 0,9mg/ml vào thời điểm giá trị OD600nm của canh trƣờng nuôi cấy đạt 0,6 và thực hiện việc thu nhận enzyme sau 8 giờ bổ sung chất cảm ứng.

2.KIẾN NGHỊ

Tiến hành xây dựng và thực hiện mô hình tối ƣu hóa các điều kiện nuôi cấy để đạt lƣợng enzyme cao nhất.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu tiếng Việt

Đỗ Biên Cƣơng, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Huyền, Đặng Thị Thu (2010), Nghiên cứu chuyển hóa bã cơm dừa tạo prebiotisc mannooligosaccharide bằng endo-beta-1,4- mannanase từ Aspergillus niger BK01, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 48(3): 43- 49.

Lê Thị Thu Giang, Quyền Đình Thi, Vũ Thị Cao Hậu, Đặng Thị Thu (2003), Sinh tổng hợp và xác định một số tính chất của endo-beta-1,4-mannanase chủng Bacillus thuringensis DDH2. Báo cáo khoa học, Hội Nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2003, Hà Nội, 16-17/12/2003, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ thuật: 1204-1208.

Trịnh Thị Thu Hà, Đồng Văn Quyền, Ngô Đình Bính (2018), Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp Chitinase của chủng vi khuản tái tổ hợp bằng phƣơng pháp đáp ứng bề mặt, Tạp chí Sinh học, 40(1): 115-123.

Cao Thị Vân Hậu (2003), Tìm chủng có khả năng tổng hợp endo- Endo-beta-1,4- mannanase, nuôi cấy, xác định các đặc tính endo-beta-1,4-mannanase chủng Bacillus thuringensis DDH2 và nhân dòng gen này, Luận án tốt nghiệp Đại học, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội.

Nguyễn Thu hiền, Hoàng Thị Thu hiền, Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Huy Hoàng (2013), Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase trong Escherichia coli BL21 (DH3) từ vi khuẩn Bacillus. Tạp chí Sinh học 35 (3): 51-57.

Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi, Phạm Việt Cƣờng, Đặng Thị Thu (2006), Endo- beta-1,4-mannanase từ B. subtilis G1: Chọn chủng, xác định động thái sinh trƣờng, nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 4: 327- 334.

Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Phạm Việt Cƣờng(2008), Biểu hiện endo từ chủng Bacillus subtilis G1 ở Escherichia coli và một số tính chất của enzyme tái tổ hợp, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(2): 183-189.

Tài liệu nước ngoài

Boraston A. B., Bolam D. N., Gilbert H. J., Davies G. J. (2004) Carbohydrate-binding module: fine tuning polysaccharide recognition. J Biochem 382 (3):769–781.

Kansoh A. L., Nagieb Z. A. (2004), Xylanase and Mannanase enzymes from Streptomyces galbus NR and their use in biobleaching of softwood kraft pulp,

Antonie Van Leeuwenhoek 85, 103–114.

Anwar Sunna, Moreland D. Gibbs, Charles W. J. Chin, Peter J. Nelson, Peter L. Bergquist (2000), Gene Encoding a Novel Multidomain β-1,4-Mannanase from Caldibacillus cellulovorans and Action of the Recombinant Enzyme on Kraft Pulp, Applied and Enviromental Microniology 66 (2):664-670.

Sachslehner A. and Haltrich D. (1999), Purification and some properties of a thermostable acidic endo-β-1,4-D-mannanase from Sclerotium (Athelia)

rolfsii, FEMS Microbiol Lett 177 (1): 47–55.

Bingze Xu Daniel Sellos Jan‐Christer Janson (2002), Cloning and expression in Pichia pastoris of a blue mussel (Mytilus edulis) β‐mannanase gen, Eur J Biochem 269: 1753-1760.

Moreland D. Gibbs, Anna U. Elinder, Rosalind A. Reeves, Peter L. Bergquist (1996), Sequencing, cloning and expression of a β-1,4-mannanase gen, manA, from the extremely thermophilic anaerobic bacterium, Caldicellulosiruptor Rt8B.4, FEMS Microbiology Letters 141 (1): 37-43.

Talbot G. and Sygusch J. (1990), Purification and characterization of thermostable β- mannanase and α-galactosidase from Bacillus stearothermophilus, Appl Environ Microbiol 56 (11): 3505–3510.

Soni H., Rawat H.K., Pletschke B.I. (2016), Purification and characterization of β- mannanase from Aspergillus terreus and its applicability in depolymerization of mannans and saccharification of lignocellulosic biomass, Biotechnology 6 (2): 136. Stalbrand H., Siika-aho M., Tenkanen M., and Viikari L. (1993), Purification and

characterization of two β-mannanases from Trichoderma reesei, Jouranl of Biotechnology 29 (3): 229–242.

Stalbrand H., Saloheimo A., Vehmaanpera J., Henrissat B., Penttila M. (1995), Cloning and expression in Saccharomyces cerevisiae of a Trichoderma reesei beta- mannanase gen containing a cellulose binding domain, Appl Environ Microbiol 61: 1090-1097.

Buchert J., Salminen J., Siika-Aho M., Ranua M., Viikari L. (1993), The role of Trichoderma reesei xylanase and mannanase in the treatment of softwood kraft pulp prior to bleaching, Holzforschung 47: 473–478.

Zhang J., He Z. & Hu K. (2000), Purification and characterization of β-mannanase from

Bacillus licheniformis for industrial use, Biotechnology Letters 22: 1375–1378. Isaac K.O. Cann, Svetlana Kocherginskaya, Michael R. King, Bryan A.White, Roderick

(1999), Molecular Cloning, Sequencing, and Expression of a Novel Multidomain Mannanase Gen from Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum. American Society for Microbiology 181 (5): 1643-1651.

Petty L. A., Carter S. D., Senne B. W. and Shriver J. A. (2002), Effects of ß-mannanase addition to corn-soybean meal diets on growth performance, carcass traits, and nutrient digestibility of weanling and growing-finishing pigs, Anim Sci. 80(4): 1012-1019.

Zhang L., and Tizzard I.R. (1996), Activation of a mouse macrophage cell line by acemannan: the major carbohydrate fraction from Aloe vera gel,

Immunopharmacology 35 (2): 119-128.

Marina Duarte Pinto Lobo, Fredy Davi Albuquerque Silva, Patriscia Gadelha de Castro Landim, Paloma Ribeiro Da Cruz (2013), Expression and efficient secretion of a functional chitinase from Chromobacterium violaceum in Escherichia coli, BMC Biotechnology, Article number: 46.

Adibmoradi M., Mehri M. (2007), Effects of β-mannanase on broiler performance and gut morphology, 16th European Symposium on Poultry Nutrition, Stasburg, France, 471–47.

Blibech M., Ghorbel R. E., Fakhfakh I., Ntarima P., Piens K., Bacha A. B., Chaabouni S. E. (2010), Purification and characterization of a low molecular weight of β-

mannanases from Penicillium occitanis Pol6, App Biochem Biotechnol 160:1227– 1240.

Chandra M. R. S., Lee Y. S., Park I. H., Zhou Y., Kim K. K., Choi Y. L. (2011), Isolation, purification and characterization of a thermostable β-mannanase from Paenibacillus sp. DZ3, J Korean Soc, Appl BioChem Biotechnol 54(3):325– 331

Jackson M. E., Fodge D. W., and Hsiao H. Y. (1999), Effects of β-Mannanase in Corn- Soybean Meal Diets on Laying Hen Performance, Poultry Science 78 (12):1737– 1741.

Zakaria M. M, Yamamoto S., Yagi T., Purification and characterization of an endo-1,4-β- mannanase from Bacillus subtilis KU-1 (1998), FEMS Microbiology Letters,

158(1): 25–31.

Mehri M., Adibmoradi M., Samie A., Shivazad M. (2010), Effects of β-Mannanase on broiler performance, gut morphology and immune system, African Journal of Biotechnology 9 (37): 6221-6228.

Arcand N., Kluepfel D., Paradis F. W., Morosoli R., Shareck F. (1993), β-Mannanase of Streptomyces lividans 66: cloning and DNA sequence of the manA gen and characterization of the enzyme, Biochem 290 (3): 857–863.

Mendoza N. S., Arai M., Sugimoto K., Ueda M., Kawaguchi T., Joson L. M. (1995), Cloning and sequencing of β-mannanase gen from Bacillus subtilis NM-39,

Biochim Biophys Acta 1243 (3): 552-554.

Takeda N., Hirasawa K., Uchimura K., Nogi Y., Hatada Y., Usami R., Yoshida Y. and Grant W. D. (2004), Purification and enzymatic properties of a highly alkaline mannanase from alkaliphilic Bacillus sp. strain JAMB-750, Biol Macromol 4 (2): 67–74.

Nathalie Ethier, Guylaine Talbot, Jurgen Sygusch (1998), Gen Cloning, DNA Sequencing and Expression of Thermostable β-Mannanase from Bacillus stearothermophilus, Appl Envion Microbiol 64 (11): 4428-4432.

Politz O., Krah M., Thomsen K. K., Borriss R. (2000), A highly thermostable endo-(1,4)- β-mannanase from the marine bacterium Rhodothermus marinus, Appl Microbiology Biotechnology 53: 715-721.

Adenmark P., Varga A., Medve J., Harjunpaa V., Drakenberg T., Terneld F., Stalbrand H. (1998), Softwood hemicelluloses-degrading enzymes from Aspergillus niger: purification and properties of a β-mannanase, Biotechnol 63 (3):199–210.

Agrawal P., Verma D., Daniell H. (2011), Expression of Trichoderma reesei β- mannanase in tobacco chloroplasts and its utilization in lignocellulosic woody biomass hydrolysis, PLoS One 6(12):e29302.

Bhoria P., Singh G., Hoondal G. S. (2009), Optimization of mannanase production from Streptomyces sp. PG-08-03 in submerged fermentation, Bioresources 4 (3): 1130–1138.

Prakram Singh ChauHan, Neena Puri, Prince Sharma and Navee Gupta (2012), Mannanases: microbial sources, production, properties and potential biotechnological applications, Applied Microbiology and Biotechnology 93: 1817- 1803.

Chauhan P. S., Sharma P., Puri N. (2014), A process for reduction in viscosity of coffee extract by enzymatic hydrolysis of mannan, Bioprocess Biosyst Eng. 37 (7): 1459– 1467.

Pierre Marraccini, John W. Rogers, Cyril Allard, Marie-Laure Andre, Victoria Caillet, Nicolas Lacoste, Francoise Lausanne & Stephane Michaux (2001), Molecular and biochemical characterization of endo-β-mannanases from germinating coffee (Coffea arabica) grains, Planta 213: 296-308.

Zhang Q., Yan X., Zhang L. & Tang W. ( 2006), Cloning, sequence analysis, and