4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
3.4. ẢNH HƢỞNG CỦA THỜI ĐIỂM THU TẾ BÀO ĐẾN SỰ BIỂU HIỆN CỦA
CỦA MANNANASE
Thời gian lên men là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến sự biểu hiện của protein tái tổ hợp mannanase, vì lƣợng protein đƣợc tổng hợp ở các thời điểm là khác nhau. Nếu thu sớm thì protein chƣa tổng hợp đƣợc tối đa, nếu thu muộn thì sinh ra các chất ức chế và phân hủy protein mới đƣợc tạo thành. Vì khi môi trƣờng thiếu dinh dƣỡng, tế bào sẽ tiết ra protease để thủy phân, chuyển hóa các tế bào chết và các sản phẩm phụ thành nguồn dinh dƣỡng cho tế bào, do đó các sản phẩm protein tái tổ hợp thƣờng bị thủy phân bởi protease (Shojaosadati và cs, 2008). Do đó, tiến hành khảo sát thời gian thu nhận tế bào để chọn thời điểm thu đƣợc hoạt độ enzyme là cao nhất. Kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.3 và Hình 3.5.
21
Bảng 3.3. Hoạt độ enzyme tại các thời điểm thu tế bào.
Thời điểm thu tế bào (giờ) Hoạt độ enzyme (U/ml)
2 14,9805±0,15bc
4 15,1333±0,16bc
6 15,2916±0,25ab
8 15,6992±0,32a
24 14,6114±0,03c
(Số liệu trong bảng là trung bình của 2 lần lặp lại. Các chữ số khác nhau trong cùng một cột biểu thị sự khác biệt có ý nghĩa của các nghiệm thức khảo sát theo kiểm định Duncan ở độ tin cậy 95%).
Hình 3.5. Ảnh hƣởng của thời gian thu tế bào đến hoạt độ enzyme.
Kết quả ở hình 3.5 cho thấy, sau 2 giờ bổ sung chất cảm ứng hoạt độ của mannanase tái tổ hợp bắt đầu tăng, đến 8 giờ thì đạt cực đại (15,6992 U/ml), sau đó bắt đầu giảm đến 24 giờ thì hoạt độ còn 14,6114 U/ml. Kết quả này cho thấy khoảng thời gian thích hợp cho quá trình thu tế bào để thu nhận enzyme đạt đƣợc hoạt độ cao là từ 2 đến 8 giờ. Theo một nghiên cứu khác của Trịnh Thị Hà và cs (2018) khi nghiên cứu biểu hiện của ChiA tái tổ hợp trong hệ thống biểu hiện E.coli BL21 cho thấy sau 3 giờ bổ sung chất cảm ứng thì hoạt tính enzyme của chitinase tái tổ hợp mới bắt đầu tăng và đạt cực đại sau 9 giờ. Nhƣ vậy, trên cùng một hệ thống biểu hiện là E.coli BL21 thì thời gian để thu nhận các loại protein tái tổ hợp khác nhau là khác nhau.
22
Do đó lựa chọn thời giancho việc thu tế bào để sinh mannanase tối ƣu nhất là sau 8 giờ từ lúc bổ sung chất cảm ứng.
23
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1.KẾT LUẬN
Trên cơ sở kết quả thu đƣợc và tổng hợp từ những dữ liệu đƣa ra đƣợc những kết luận sau:
- Sau khi biến nạp vecto pBAD3014ManB vào E.coli BL21 không làm ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của tế bào.
-Hoạt độ mannanase đạt giá trị cao nhất 15,6992 U/ml khi tiến hành lên men vi sinh vật E.coli BL21/pBAD3014ManB trong môi trƣờng LB có bổ sung chất cảm ứng L- arabinose với nồng độ 0,9mg/ml vào thời điểm giá trị OD600nm của canh trƣờng nuôi cấy đạt 0,6 và thực hiện việc thu nhận enzyme sau 8 giờ bổ sung chất cảm ứng.
2.KIẾN NGHỊ
Tiến hành xây dựng và thực hiện mô hình tối ƣu hóa các điều kiện nuôi cấy để đạt lƣợng enzyme cao nhất.
24
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
Đỗ Biên Cƣơng, Nguyễn Thị Hoa, Lê Thị Huyền, Đặng Thị Thu (2010), Nghiên cứu chuyển hóa bã cơm dừa tạo prebiotisc mannooligosaccharide bằng endo-beta-1,4- mannanase từ Aspergillus niger BK01, Tạp chí Khoa học và Công nghệ, 48(3): 43- 49.
Lê Thị Thu Giang, Quyền Đình Thi, Vũ Thị Cao Hậu, Đặng Thị Thu (2003), Sinh tổng hợp và xác định một số tính chất của endo-beta-1,4-mannanase chủng Bacillus thuringensis DDH2. Báo cáo khoa học, Hội Nghị Công nghệ sinh học toàn quốc 2003, Hà Nội, 16-17/12/2003, Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ thuật: 1204-1208.
Trịnh Thị Thu Hà, Đồng Văn Quyền, Ngô Đình Bính (2018), Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp Chitinase của chủng vi khuản tái tổ hợp bằng phƣơng pháp đáp ứng bề mặt, Tạp chí Sinh học, 40(1): 115-123.
Cao Thị Vân Hậu (2003), Tìm chủng có khả năng tổng hợp endo- Endo-beta-1,4- mannanase, nuôi cấy, xác định các đặc tính endo-beta-1,4-mannanase chủng Bacillus thuringensis DDH2 và nhân dòng gen này, Luận án tốt nghiệp Đại học, Trƣờng Đại học Bách Khoa Hà Nội.
Nguyễn Thu hiền, Hoàng Thị Thu hiền, Khuất Hữu Thanh, Nguyễn Huy Hoàng (2013), Chọn dòng và biểu hiện gen keratinase trong Escherichia coli BL21 (DH3) từ vi khuẩn Bacillus. Tạp chí Sinh học 35 (3): 51-57.
Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Quyền Đình Thi, Phạm Việt Cƣờng, Đặng Thị Thu (2006), Endo- beta-1,4-mannanase từ B. subtilis G1: Chọn chủng, xác định động thái sinh trƣờng, nhân dòng và phân tích trình tự gen mã hóa, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 4: 327- 334.
Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh, Phạm Việt Cƣờng(2008), Biểu hiện endo từ chủng Bacillus subtilis G1 ở Escherichia coli và một số tính chất của enzyme tái tổ hợp, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(2): 183-189.
25
Tài liệu nước ngoài
Boraston A. B., Bolam D. N., Gilbert H. J., Davies G. J. (2004) Carbohydrate-binding module: fine tuning polysaccharide recognition. J Biochem 382 (3):769–781.
Kansoh A. L., Nagieb Z. A. (2004), Xylanase and Mannanase enzymes from Streptomyces galbus NR and their use in biobleaching of softwood kraft pulp,
Antonie Van Leeuwenhoek 85, 103–114.
Anwar Sunna, Moreland D. Gibbs, Charles W. J. Chin, Peter J. Nelson, Peter L. Bergquist (2000), Gene Encoding a Novel Multidomain β-1,4-Mannanase from Caldibacillus cellulovorans and Action of the Recombinant Enzyme on Kraft Pulp, Applied and Enviromental Microniology 66 (2):664-670.
Sachslehner A. and Haltrich D. (1999), Purification and some properties of a thermostable acidic endo-β-1,4-D-mannanase from Sclerotium (Athelia)
rolfsii, FEMS Microbiol Lett 177 (1): 47–55.
Bingze Xu Daniel Sellos Jan‐Christer Janson (2002), Cloning and expression in Pichia pastoris of a blue mussel (Mytilus edulis) β‐mannanase gen, Eur J Biochem 269: 1753-1760.
Moreland D. Gibbs, Anna U. Elinder, Rosalind A. Reeves, Peter L. Bergquist (1996), Sequencing, cloning and expression of a β-1,4-mannanase gen, manA, from the extremely thermophilic anaerobic bacterium, Caldicellulosiruptor Rt8B.4, FEMS Microbiology Letters 141 (1): 37-43.
Talbot G. and Sygusch J. (1990), Purification and characterization of thermostable β- mannanase and α-galactosidase from Bacillus stearothermophilus, Appl Environ Microbiol 56 (11): 3505–3510.
Soni H., Rawat H.K., Pletschke B.I. (2016), Purification and characterization of β- mannanase from Aspergillus terreus and its applicability in depolymerization of mannans and saccharification of lignocellulosic biomass, Biotechnology 6 (2): 136. Stalbrand H., Siika-aho M., Tenkanen M., and Viikari L. (1993), Purification and
characterization of two β-mannanases from Trichoderma reesei, Jouranl of Biotechnology 29 (3): 229–242.
26
Stalbrand H., Saloheimo A., Vehmaanpera J., Henrissat B., Penttila M. (1995), Cloning and expression in Saccharomyces cerevisiae of a Trichoderma reesei beta- mannanase gen containing a cellulose binding domain, Appl Environ Microbiol 61: 1090-1097.
Buchert J., Salminen J., Siika-Aho M., Ranua M., Viikari L. (1993), The role of Trichoderma reesei xylanase and mannanase in the treatment of softwood kraft pulp prior to bleaching, Holzforschung 47: 473–478.
Zhang J., He Z. & Hu K. (2000), Purification and characterization of β-mannanase from
Bacillus licheniformis for industrial use, Biotechnology Letters 22: 1375–1378. Isaac K.O. Cann, Svetlana Kocherginskaya, Michael R. King, Bryan A.White, Roderick
(1999), Molecular Cloning, Sequencing, and Expression of a Novel Multidomain Mannanase Gen from Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum. American Society for Microbiology 181 (5): 1643-1651.
Petty L. A., Carter S. D., Senne B. W. and Shriver J. A. (2002), Effects of ß-mannanase addition to corn-soybean meal diets on growth performance, carcass traits, and nutrient digestibility of weanling and growing-finishing pigs, Anim Sci. 80(4): 1012-1019.
Zhang L., and Tizzard I.R. (1996), Activation of a mouse macrophage cell line by acemannan: the major carbohydrate fraction from Aloe vera gel,
Immunopharmacology 35 (2): 119-128.
Marina Duarte Pinto Lobo, Fredy Davi Albuquerque Silva, Patriscia Gadelha de Castro Landim, Paloma Ribeiro Da Cruz (2013), Expression and efficient secretion of a functional chitinase from Chromobacterium violaceum in Escherichia coli, BMC Biotechnology, Article number: 46.
Adibmoradi M., Mehri M. (2007), Effects of β-mannanase on broiler performance and gut morphology, 16th European Symposium on Poultry Nutrition, Stasburg, France, 471–47.
Blibech M., Ghorbel R. E., Fakhfakh I., Ntarima P., Piens K., Bacha A. B., Chaabouni S. E. (2010), Purification and characterization of a low molecular weight of β-
27
mannanases from Penicillium occitanis Pol6, App Biochem Biotechnol 160:1227– 1240.
Chandra M. R. S., Lee Y. S., Park I. H., Zhou Y., Kim K. K., Choi Y. L. (2011), Isolation, purification and characterization of a thermostable β-mannanase from Paenibacillus sp. DZ3, J Korean Soc, Appl BioChem Biotechnol 54(3):325– 331
Jackson M. E., Fodge D. W., and Hsiao H. Y. (1999), Effects of β-Mannanase in Corn- Soybean Meal Diets on Laying Hen Performance, Poultry Science 78 (12):1737– 1741.
Zakaria M. M, Yamamoto S., Yagi T., Purification and characterization of an endo-1,4-β- mannanase from Bacillus subtilis KU-1 (1998), FEMS Microbiology Letters,
158(1): 25–31.
Mehri M., Adibmoradi M., Samie A., Shivazad M. (2010), Effects of β-Mannanase on broiler performance, gut morphology and immune system, African Journal of Biotechnology 9 (37): 6221-6228.
Arcand N., Kluepfel D., Paradis F. W., Morosoli R., Shareck F. (1993), β-Mannanase of Streptomyces lividans 66: cloning and DNA sequence of the manA gen and characterization of the enzyme, Biochem 290 (3): 857–863.
Mendoza N. S., Arai M., Sugimoto K., Ueda M., Kawaguchi T., Joson L. M. (1995), Cloning and sequencing of β-mannanase gen from Bacillus subtilis NM-39,
Biochim Biophys Acta 1243 (3): 552-554.
Takeda N., Hirasawa K., Uchimura K., Nogi Y., Hatada Y., Usami R., Yoshida Y. and Grant W. D. (2004), Purification and enzymatic properties of a highly alkaline mannanase from alkaliphilic Bacillus sp. strain JAMB-750, Biol Macromol 4 (2): 67–74.
Nathalie Ethier, Guylaine Talbot, Jurgen Sygusch (1998), Gen Cloning, DNA Sequencing and Expression of Thermostable β-Mannanase from Bacillus stearothermophilus, Appl Envion Microbiol 64 (11): 4428-4432.
28
Politz O., Krah M., Thomsen K. K., Borriss R. (2000), A highly thermostable endo-(1,4)- β-mannanase from the marine bacterium Rhodothermus marinus, Appl Microbiology Biotechnology 53: 715-721.
Adenmark P., Varga A., Medve J., Harjunpaa V., Drakenberg T., Terneld F., Stalbrand H. (1998), Softwood hemicelluloses-degrading enzymes from Aspergillus niger: purification and properties of a β-mannanase, Biotechnol 63 (3):199–210.
Agrawal P., Verma D., Daniell H. (2011), Expression of Trichoderma reesei β- mannanase in tobacco chloroplasts and its utilization in lignocellulosic woody biomass hydrolysis, PLoS One 6(12):e29302.
Bhoria P., Singh G., Hoondal G. S. (2009), Optimization of mannanase production from Streptomyces sp. PG-08-03 in submerged fermentation, Bioresources 4 (3): 1130–1138.
Prakram Singh ChauHan, Neena Puri, Prince Sharma and Navee Gupta (2012), Mannanases: microbial sources, production, properties and potential biotechnological applications, Applied Microbiology and Biotechnology 93: 1817- 1803.
Chauhan P. S., Sharma P., Puri N. (2014), A process for reduction in viscosity of coffee extract by enzymatic hydrolysis of mannan, Bioprocess Biosyst Eng. 37 (7): 1459– 1467.
Pierre Marraccini, John W. Rogers, Cyril Allard, Marie-Laure Andre, Victoria Caillet, Nicolas Lacoste, Francoise Lausanne & Stephane Michaux (2001), Molecular and biochemical characterization of endo-β-mannanases from germinating coffee (Coffea arabica) grains, Planta 213: 296-308.
Zhang Q., Yan X., Zhang L. & Tang W. ( 2006), Cloning, sequence analysis, and heterologous expression of a β-mannanase gen from Bacillus subtilis Z-2,
Molekuliarnaia Biologiia 40 (3): 418-424.
Shojaosadati S. A., Kolaei S. M. V., Babaeipourl V., Farnoud A. M. (2008), Recent advances in high cell density cultivation for production of recombinant protein,
29
Theodor Escherich (1988), The intestinal bacteria of the neonate and breast-fed ifnant, Clinical Infectious Disease 10 (6): 1220–1225.
Puchart V., Vrsanska M., Svoboda P., Pohl J., Ogel Z. B., and Biely P. (2004), Purification and characterization of two forms of endo-β-1,4-mannanase from a thermotolerant fungus, Aspergillus fumigatus IMI 385708 (formerly Thermomyces lanuginosus IMI 158749), Biochim Biophys Acta 1674 (3): 239–250.
SVS Verma and McNab J. M. (1982), Guar meal in diets for broiler chickens, Journal Bristish Poultry Science 23 (2):95-105.
Tan X. H., Wu Y. Y., Ma L. X., Jiang S. J. (2005), Cloning and expression in Pichia pastoris of an alkaline mannanase gen. Acta Microbiologica Sinica 45 (4): 543-546.
30 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Thành phần môi trƣờng LB Trypton 10g/L NaCl 10g/L Cao nấm men 5g/L
Phụ lục 2. Mối tƣơng quan giữa OD600nm và Log (CFU/ml), đƣờng cong sinh trƣởng, tốc độ tăng trƣởng
E.coli WT E.coli BL21/pBAD3014ManB
Nồng độ
(OD600nm) Log (CFU/ml)
Nồng độ
(OD600nm) Log (CFU/ml)
0,1 8,90309 0,1 8,4777121 0,2 9,041393 0,2 8,69897 0,3 9,176091 0,3 8,90309 0,4 9,322219 0,4 9,113943 0,5 9,431364 0,5 9,278754 Thời gian (giờ)
E.coli WT E.coli BL21/pBAD3014ManB
OD600nm Log (CFU/ml) Tốc độ tăng trƣởng OD600nm Log (CFU/ml) Tốc độ tăng trƣởng 0 0,1078 8,9208 - 0,103 8,4767 - 2 0,271 9,1337 0,01065 0,2089 8,6997 0,01015 4 1,0577 10,1601 0,03098 0,7979 9,9396 0,03607 6 1,4442 10,6643 0,02911 1,303 11,0030 0,04177 8 1,6759 10,9666 0,02561 1,5371 11,4958 0,03748 10 1,8072 11,1379 0,02220 1,7587 11,9623 0,03466 12 1,9889 11,3749 0,02048 2,0082 12,4876 0,03326 14 2,1683 11,6089 0,01922 2,1733 12,8351 0,03099 16 2,1816 11,6263 0,01693 2,2001 12,8915 0,02747 18 2,2109 11,6645 0,01526 2,201 12,8934 0,02443 20 2,2443 11,7081 0,01395 2,2253 12,9446 0,02224 22 2,2699 11,7415 0,01283 2,2589 13,0153 0,02054
31 24 2,2649 11,7389 0,01175 2,2572 13,0117 0,01881 26 2,2589 11,72716 0,01081 2,2354 12,9659 0,01719 28 2,2174 11,67302 0,00984 2,2099 12,9122 0,01577 30 2,1741 11,61653 0,00899 2,1714 12,8311 0,01447 32 2,169 11,60988 0,00841 2,145 12,7756 0,01337 34 2,1373 11,56852 0,00780 2,1105 12,7029 0,01237 36 2,1047 11,52599 0,00725 2,0876 12,6547 0,01155
Phụ lục 3. Kết quả OD; thể tích thu dịch nuôi cấy; ý nghĩa mô tả, thống kê kết quả trong thí nghiệm khảo sát thời gian bổ sung chất cảm ứng
Thời gian bổ sung Giá trị sau 4 giờ bổ sung chất cảm ứng(OD600nm) Thể tích thu của dịch nuôi cấy (ml) OD600nm=0,3 1,8547±0,78 10,8 OD600nm=0,6 1,6286±0,59 12,3 OD600nm=0,9 1,9453±0,23 10,3 OD600nm=1,2 1,9211±0,44 10,4 Descriptives N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum Maximum Lower Bound Upper Bound
0.3 3 1.31305333E1 .734510615 .424069901 11.30590782 14.95515885 1.248970E1 1.393210E1
0.6 3 1.40825000E1 .180561707 .104247350 13.63395985 14.53104015 1.387540E1 1.420690E1
0.9 3 1.27702000E1 .509484563 .294151050 11.50457018 14.03582982 1.220960E1 1.320500E1
1.2 3 1.02486333E1 .872703967 .503855870 8.08071650 12.41655017 9.248900 1.085810E1
32
Homogenous Subsets
Thời gian bổ sung chất cảm
ứng N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3 Dunca na 1.2 3 1.02486333E1 0.9 3 1.27702000E1 0.3 3 1.31305333E1 1.31305333E1 0.6 3 1.40825000E1 Sig. 1.000 .504 .102
Means for groups in homogenous subsets are displayed. Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000.
Phụ lục 4. Kết quả OD; thể tích dịch nuôi cấy; ý nghĩa mô tả, thống kê kết quả trong thí nghiệm khảo sát nồng độ chất cảm ứng
Nồng độ chất cảm ứng (mg/ml)
Giá trị sau 4 giờ bổ sung chất cảm ứng(OD600nm) Thể tích thu của dịch nuôi cấy (ml) 0,5 1,8527±1,01 10,8 0,7 1,7820±0,87 11,2 0,9 1,8543±0.63 10,8 1,1 1,7846±0.81 11,2 1,3 1,7984±0.92 11,1 Descriptives N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum Maximum Lower
Bound Upper Bound
0 2 1.235810E1 .3338958 .2361000 9.358165 15.358035 12.1220 12.5942 0.5 2 1.317905E1 1.0836411 .7662500 3.442921 22.915179 12.4128 13.9453 0.7 2 1.357155E1 .0021920 .0015500 13.551855 13.591245 13.5700 13.5731 0.9 2 1.478815E1 .9177539 .6489500 6.542458 23.033842 14.1392 15.4371 1.1 2 1.398745E1 .3869995 .2736500 10.510397 17.464503 13.7138 14.2611 1.3 2 1.383580E1 .1016820 .0719000 12.922224 14.749376 13.7639 13.9077 Total 12 1.362002E1 .9024627 .2605185 13.046619 14.193414 12.1220 15.4371
33
Phụ lục 5. Kết quả OD; thể tích dịch nuôi cấy; ý nghĩa mô tả, thống kê kết quả trong thí nghiệm khảo sát thời điểm thu tế bào
Thời điểm thu tế bào (giờ)
Giá trị sau các thời điểm (OD600nm) Thể tích thu của dịch nuôi cấy (ml) 2 1,24±0,67 16,1 4 1,46±1,2 13,7 6 1,55±0,41 12,9 8 1,79±0,53 11,2 24 4±0,77 4,9 Homogenous Subsets Nồng độ cảm ứng N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3
Duncana 0 2 1.235810E1
0.5 2 1.317905E1 1.317905E1
0.7 2 1.357155E1 1.357155E1 1.357155E1
1.3 2 1.383580E1 1.383580E1 1.383580E1
1.1 2 1.398745E1 1.398745E1
0.9 2 1.478815E1
Sig. .064 .257 .110
Means for groups in homogenous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.
34 Descriptives N Mean Std. Deviation Std. Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum Maximum Lower Bound Upper Bound
2 2 1.49804900E1 .147601470 .104370000 13.65434341 16.30663659 1.487612E1 1.508486E1
4 2 1.51333300E1 .162026448 .114570000 13.67758012 16.58907988 1.501876E1 1.524790E1
6 2 1.52910600E1 .246398429 .174230000 13.07725795 17.50486205 1.511683E1 1.546529E1
8 2 1.56991900E1 .321507311 .227340000 12.81056142 18.58781858 1.547185E1 1.592653E1
24 2 1.46113800E1 .027633733 .019540000 14.36310076 14.85965924 1.459184E1 1.463092E1
Total 10 1.51430900E1 .407385331 .128826553 14.85166409 15.43451591 1.459184E1 1.592653E1
Homogenous Subsets
Thời gian thu tế bào
N
Subset for alpha = 0.05
1 2 3 Duncana 24 2 1.46113800E1 2 2 1.49804900E1 1.49804900E1 4 2 1.51333300E1 1.51333300E1 6 2 1.52910600E1 1.52910600E1 8 2 1.56991900E1 Sig. .058 .203 .105
Means for groups in homogenous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = 2.000.
35
Phụ lục 6. Đƣờng chuẩn mannose trong các thí nghiệm khảo sát
Đƣờng chuẩn trong thí nghiệm khảo sát thời gian bổ sung chất cảm ứng
Đƣờng chuẩn trong thí nghiệm khảo sát nồng độ chất cảm ứng
Đƣờng chuẩn trong thí nghiệm khảo sát nồng độ chất cảm ứng y = 0.1279x + 0.0489 R² = 0.9996 0 0.1