4. Cấu trúc của khóa luận
1.4.2. Các iridoidglucosid dạng đime
Gần đây, nghiên cứu về rễ cây mơ tam thể ở Việt Nam, Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã tinh sạch được ba hợp chất iridoid glucosid dạng dime (6), (7), (8) [4]. Đây là những đime đầu tiên được tìm thấy trong chi Paederia sp. Đime (6) tạo thành do sự kết hợp của hai monome paederosidic axit methyl ester và paederosidic axit qua liên kết giữa nhóm cacboxylic của axit paederosidic và nhóm 6-OH trong phần đường của axit paederosidic metyl ester.
O CH3-S-CO-CH2 H H H COOCH3 H H H OH O O HO CHOH2 O HO O O CH3-S-CO-CH2 H H H CO H H H OH O HO CHOH2OH O HO (6) O CH2 H H H COOH H CH3-S-CO H H O OH O O HO HO O OH O CH2 H H H CO H CH3-S-CO H H O OH HO O HO HO O OH (7)
Trong khi đó đime (7) được tạo thành từ hai phân tử axit paederosidic, có thể dự đoán hợp chất này tạo thành do sự este hóa của nhóm axit cacboxylic trong axit paederosidic với nhóm 3-OH của glucozơ trong phân tử axit paederosidic kia. Sự gắn kết này được khẳng định qua phổ FAB-MS, 2DNMR đặc biệt là tương quan giữa H-3 của phần đường và nhóm cacbonyl trong nhóm este của monome kia.
Đime thứ 3 là hợp chất (8) cũng được tạo thành từ hai monome paederoside.
O CH3-S-CO-CH2 H H H CO H H H O O RO O RO RO O O O CH3-S-CO-CH2 H H H CO H H H OH O RO O RO RO O OR (8) 1.4.3. Các anthraquinon
Đây cũng là một trong các thành phần chính của các cây thuộc họ Cà phê. Tuy nhiên, việc phát hiện ra các hợp chất anthraquinon từ Cây mơ tam thể còn rất hạn chế. Gần đây, Đặng Ngọc Quang và cộng sự đã tinh sạch được 7 hợp chất anthraquinon từ (9) đến (15) và một coumarin (16) từ rễ cây mơ tam thể của Việt
Nam chúng là những hợp chất có hoạt tính kháng sinh mạnh [5], [6]. O
O O OH OCH3 OH OCH3 (9) O O OCH3 OCH3 OH (10) O O OCH3 OH OCH3 (11) O O OH CH2OH (12) O O OCH3 OH OCH3 OCH3 13 O O OCH3 OCH3 OH 14 O O OCH3 OH 15 O OCH3 16 O OH
Các ấn phẩm trước đây chỉ ra rằng anthraquinon là các hợp chất có nhiều hoạt tính sinh học quý giá, chẳng hạn như ức chế Epstein-Barr virus [13], kháng virus [15] và hoạt tính gây độc tế bào [17].
(13) (14)
1.5. CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU HỢP CHẤT HỮU CƠ 1.5.1. Phƣơng pháp chiết lỏng - lỏng
a. Nguyên tắc và điều kiện
Nguyên tắc (Hình 1.3)
Nguyên tắc của kỹ thuật chiết này là dựa trên cơ sở sự phân bố của chất phân tích vào hai pha lỏng (2 dung môi) không trộn lẫn được vào nhau (trong hai dung môi này, có thể một dung môi có chứa chất phân tích) được để trong một dụng cụ chiết, như phễu chiết, bình chiết. Và thế hệ số phân bố nhiệt động Kb của cân bằng chiết là một yếu tố quyết định hiệu quả của sự chiết và tiếp đến là sự ảnh hưởng của nhiệt độ, môi trường axit và Kpb là hằng số nhiệt động. Chiết theo kiểu này có hai cách là chiết tĩnh và chiết theo dòng chảy liên tục. Trong phân tích, kiểu tĩnh được ứng dụng nhiều hơn, và sự đơn giản của nó. [19]
Hình 1.3. Sơ đồ nguyên tắc chiết lỏng/lỏng
Điều kiện
Để có được kết quả chiết tốt, quá trình chiết phải có các điều kiện và đảm bảo được các yêu cầu nhất định sau đây:
- Dung môi chiết phải tinh khiết cao, để không làm nhiễm bẩn thêm các chất phân tích vào mẫu.
- Dung môi chiết phải hoà tan tốt các chất phân tích, nhưng lại không hoà tan tốt với các chất khác có trong mẫu.
- Hệ số phân bố của hệ chiết phải lớn, để cho sự chiết được triệt để. - Cân bằng chiết nhanh đạt được và thuận nghịch, để giải chiết được tốt. - Sự phân lớp khi chiết phải rõ ràng, nhanh và dễ tách ra riêng biệt các pha.
- Phải chọn môi trường axit, pH, loại axit thích hợp,
- Phải thực hiện trong nhiệt độ phù hợp và giữ không đổi trong cả quá trình.
- Phải lắc hay trộn đều mạnh để quá trình chiết xảy ra được tốt.
b.Các phương pháp chiết lỏng – lỏng
Phƣơng pháp chiết tĩnh
Phương pháp chiết này đơn giản, không cần máy móc phức tạp, mà chỉ cần một số phễu chiết (dung tích 100, 250, 500 mL), là có thể tiến hành được ở mọi phòng thí nghiệm. Việc lắc chiết có thể thực hiện bằng tay, hay bằng máy lắc nhỏ. Tất nhiên khi phải làm hàng loạt mẫu thì mất nhiều thời gian. Hiện nay người ta đó cung cấp các hệ chiết đơn giản có 6, 9 hay 12 phễu với máy lắc nhỏ, nên việc thựchiện chiết cũng dễ dàng và dễ đồng nhất điều kiện.
Phƣơng pháp chiết dòng chảy liên tục
Trong phương pháp chiết này, khi thực hiện chiết, hai pha lỏng không trộn được vào nhau (hai dung môi, có một dung môi có chứa chất phân tích) được bơm liên tục và đi ngược chiều nhau với tốc độ nhất định trong hệ chiết, như phễu chiết, hay bình chiết liên hoàn đúng kín để chúng tiếp xúc với nhau. Hoặc cũng có thể chỉ một dung môi chuyển động, cần một pha đứng yên trong bình. Khi đó, chất phân tích sẽ được phân bố vào hai dung môi theo tính chất của chúng, để đạt đến trạng thái cân bằng. Chiết theo cách này hiệu suất cao. Đây là phương pháp chiết được ứng dụng trong chiết sản xuất công nghệ. Để thực hiện cách chiết này, phải có hệ thống máy chiết, cột chiết hay bình chiết, có bơm để bơm các chất theo dòng chảy ngược chiều nhau với tốc độ nhất định thích hợp, hoặc chỉ một chất, hay cả 2 chất chuyển động ngược chiều nhau, và phải có bộ tách pha, để tách các chất ngay trong quá trình chiết, để lấy chất được chiết ra liên tục, hay theo từng thời điểm (chu kỳ) nhất định, mà cân bằng chiết đạt được.
c. Ưu, nhược điểm và phạm vi ứng dụng
Phương pháp chiết tĩnh đơn giản, dễ thực hiện, đó và đang được ứng dụng phổ biến và rất có hiệu quả trong lĩnh vực tách chiết phân tích và làm giàu các chất
phân tích phục vụ cho việc xác định hàm lượng vết. Nhất là tách và làm giàu các kim loại, các chất hữu cơ, HCBVTV độc hại trong các mẫu nước, nước thải, nước biển,...
- Các ưu và nhược điểm chung của kỹ thuật chiết là:
+ Dùng được cho cả chiết phân tích và sản xuất tách chiết lượng lớn,
+ Lấy riêng chất phân tích, loại được các chất ảnh hưởng, nhất là chất nền của mẫu.
+ Thích hợp cho làm giàu lượng nhỏ chất phân tích (có thể 10-50 lần). + Phục vụ cho chiết được cả các chất vô cơ và các chất hữu cơ.
+ Sản phẩm chiết phù hợp được cho nhiều phương pháp phân tích.[19]
1.5.2. Phƣơng pháp sắc ký ghép khối phổ (GC-MS)
a.Phương pháp sắc ký khí
Lý thuyết chung
Sắc ký khí là một trong những phương pháp quan trọng nhất hiện nay dùng để tách, định lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu các chất hữu cơ.
Nguyên lý
- Nguyên lý cơ bản của sự tách bằng sắc ký khí là sự phân bố chất thử thành hai pha. Một pha gọi là pha tĩnh có bề mặt tiếp xúc rộng và pha kia gọi là pha động là chất khí di chuyển đi qua pha tĩnh.
- Chất thử có thể là chất khí lỏng hoặc rắn được chuyển thành thể bay hơi nhờ một luồng khí trơ làm chất tải, dẫn đi qua pha tĩnh. Nếu pha tĩnh là một chất rắn thì gọi là sắc ký khí – rắn. Chất rắn được dùng là những chất có tính hấp phụ như silicagel, than hoạt tính, oxy nhôm, rây phân tử.
- Nếu pha tĩnh là chất lỏng thì gọi là sắc ký khí – lỏng. Chất lỏng được phân tán mỏng như một lớp phim trên bề mặt một chất rắn trơ gọi là nền. Khi chất thử được khí tải dẫn đi ngang qua lớp chất lỏng, chúng bị tách riêng ra tùy theo hệ số phân bố của mỗi thành phần trong hỗn hợp chất thử với những điều kiện nhiệt độ khác nhau.
- Phạm vi nhiệt độ được sử dụng trong sắc ký khí rất rộng, có thể đến 4000C, nhờ vậy làm tăng ưu thế của phương pháp sắc ký khí trong việc tách các thành phần ra khỏi hỗn hợp của chúng.
Dụng cụ
Mẫu được bơm vào trong và theo dòng khí mang (khí mang thường là N2) đưa đến cột sắc ký (pha tĩnh). Mẫu khi qua cột này sẽ được hấp phụ lên trên pha tĩnh đó. Sau đó, các chất lần lượt tách khỏi cột theo dòng khí ra ngoài được ghi nhận bởi đầu dò. Từ các tín hiệu nhận được máy tính sẽ xử lý và biểu hiện kết quả bằng sắc ký đồ.Các chất được xác định nhờ giá trị thời gian lưu trên sắc ký đồ.
Hệ thống sắc ký khí (Hình 1.4) bao gồm các thành phần cơ bản như sau: - Nguồn cung cấp khí mang: Có thể sử dụng bình chứa khí hoặc các thiết bị sinh khí (thiết bị tách khí N2 từ không khí, thiết bị cung cấp khí H2 từ nước cất,…).
- Lò cột: dùng để điều khiển nhiệt độ cột phân tích.
- Bộ phận tiêm mẫu: Bộ phận tiêm mẫu dùng để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi. Khi đưa mẫu vào cột, có thể sử dụng chế độ chia dòng (split) và không chia dòng (splitless). Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (Autosamper – có hoặc không có bộ phận hóa hơi - headspace).
- Cột phân tích: Có 2 loại cột là cột nhồi và cột mao quản.
+ Cột nhồi (packed column): pha tĩnh được nhồi vào trong cột, cột có đường kính 2-4mm và chiều dài 2-3m.
+ Cột mao quản (capillary): pha tĩnh được phủ mặt trong (bề dày 0.2-0.5µm), cột có đường kính trong 0.1-0.5mm và chiều dài 30-100m.
- Đầu dò:
Đầu dò dùng phát hiện tín hiệu để định tính và định lượng các chất cần phân tích. Có nhiều loại đầu dò khác nhau tùy theo mục đích phân tích như đầu dò ion hóa ngọn lửa (FID-Flame Ioniation Detetor), đầu dò dẫn nhiệt (TCD-Thermal Conductivity Detector), đầu dò cộng kết điện tử (ECD-Electron Capture Detector), đầu dò quang hóa ngọn lửa (FPD-Flame Photometric Detector), đầu dò NPD (NPD-
Nitrogen Phospho Detector), đầu dò khối phổ (MS-Mass Spectrometry).
-Bộ phận ghi nhận tín hiệu: Bộ phận này ghi tín hiệu do đầu dò phát hiện.
-In dữ liệu: Sau khi phân tích xong, dữ liệu sẽ được in ra qua máy in kết nối với máy tính có cài phần mềm điều khiển.
Hình 1.4. Cấu tạo hệ thống sắc ký khí
Ƣu, nhƣợc điểm của phƣơng pháp sắc ký khí -Ưu điểm
+ Có thể phân tích đồng thời nhiều hợp chất.
+ Không cần làm bay hơi mẫu.
+ Độ phân giải cao nhờ quá trình tách trên cột.
+ Độ nhạy cao nhờ đầu dò.
+ Thể tích mẫu phân tích nhỏ.
-Nhược điểm
+ Phương pháp này ít chọn lọc do không loại trừ được hết được ảnh hưởng của nền mẫu.
b.Phương pháp khối phổ (MS)
Lý thuyết chung - Đặc điểm
chính xác khối lượng phân tử chất đó. Chất nghiên cứu trước tiên được chuyển thành trạng thái hơi sau đó được đưa vào nghiên cứu trong bộ phận phân tích của máy khối phổ kế. Tùy theo loại điện tích của ion đem nghiên cứu mà người ta phân biệt máy khối phổ ion dương hay âm. Loại máy khối phổ làm việc với ion dương cho nhiều thông tin hơn về ion nghiên cứu nên được dùng phổ biến hơn.
+ Người ta có thể dùng phương pháp khối phổ để nghiên cứu tất cả các nguyên tố hay hợp chất có thể biến thành dạng khí hay hơi.
+ Với hợp chất vô cơ, phương pháp phân tích khối phổ thường được dùng để nghiên cứu thành phần đồng vị hoặc để xác định vết các chất nghiên cứu.
+ Đối với hợp chất hữu cơ, phương pháp phân tích khối phổ thường được dùng trong quá trình đồng nhất chất hoặc phân tích cấu trúc.
- Nguyên lý
+ Máy khối phổ sử dụng một chùm electron bắn vào một lượng rất bé chất thử (từ microgam đến miligam), phá chúng thành nhiều mảnh ion mang điện dương.
+ Các mảnh ion này nhờ bộ phận phát hiện và ghi thành pic với cường độ khác nhau tương ứng với lượng khối của mỗi ion.
+ Có nhiều loại máy khối phổ với mức độ phân giải (resolution) khác nhau.
+ Máy có độ phân giải cao là máy có khả năng tách được hai mảnh ion có khối lượng chỉ chênh nhau phần trăm đơn vị khối (m/e).
+ Loại máy có độ phân giải trên 10.000 là loại máy khối phổ trình độ phân giải cao. Loại máy có mức phân giải thấp nhất cũng có thể tách được các ion chênh nhau một đơn vị khối đối với các ion có số khối dưới 500m/e.
- Dụng cụ
Gồm 5 bộ phận chính:
+ Bộ phận nhận và xử lý chất thử.
+ Buồng ion hóa.
+ Bộ phận phân tích từ.
+ Bộ phận tập hợp ion và phóng đại.
- Ứng dụng
+ Xác định các hợp chất chưa biết bằng cách dựa vào khối lượng của phân tử hợp chất hay từng phần tách riêng của nó.
+ Xác định kết cấu chất đồng vị của các thành phần trong hợp chất.
+ Xác định cấu trúc của một hợp chất bằng cách quan sát từng phần riêng của nó.
c. Phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS)
Sắc ký khí ghép khối phổ (GC – MS Gas Chromatography Mass Spectometry) là một trong những phương pháp sắc ký hiện đại nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu cao, được sử dụng trong các nghiên cứu và phân tích kết hợp.
Thiết bị GC – MS được cấu tạo thành hai phần: Phần sắc ký khí (GC) dùng để phân tích hỗn hợp các chất và tìm ra chất cần phân tích, phần khối phổ (MS) mô tả các hợp phần riêng lẻ bằng cách mô tả số khối. Bằng sự kết hợp hai kĩ thuật này, các nhà hóa học có thể đánh giá, phân tích định tính và định lượng, có cách giải quyết đối với một số hóa chất.
Ngày nay, người ta ứng dụng kĩ thuật GC – MS rất nhiều và sử dụng rộng rãi trong các ngành như y học, môi trường, nông sản, kiểm nghiệm thực phẩm,...
Nguyên tắc hoạt động
Tương tự như các hệ thống sắc ký khí khác, hệ thống sắc ký khí ghép khối phổ cũng bao gồm các bộ phận: nguồn cung cấp khí, lò cột, bộ phận tiêm mẫu, cột phân tích, đầu dò, bộ phận ghi nhận tín hiệu và bộ phận in dữ liệu phân tích. Trong đó đầu dò là đầu dò khối phổ.
Các cấu tử của mẫu sau khi tách ra khỏi cột mao quản sẽ đi vào trong đầu dò khối phổ. Tại đây, tùy thuộc vào bản chất của chất cần phân tích, sẽ diễn ra quá trình ion hóa với các kiểu ion hóa khác nhau, sau đó các io được ghi nhận bởi đầu dò.
Ƣu điểm:
- Chỉ cần một lượng mẫu nhỏ.
- Kết quả thu nhận được một cách nhanh chóng (từ 1 đến 100 phút). - Độ chính xác cao.
- Độ nhạy cao, có khả năng phát hiện các cấu tử có nồng độ thấp. - Trang thiết bị không quá phức tạp.
1.5.3. Phƣơng pháp sắc ký bản mỏng
a. Nguyên tắc
Sắc ký là một nhóm các phương pháp hoá lý dùng để tách các thành phần của một hỗn hợp. Sự tách sắc ký được dựa trên sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha luôn tiếp xúc và không hoà lẫn vào nhau: một pha tĩnh và một pha động (trong thí nghiệm của Tsvet, pha tĩnh là calci carbonat và pha động là dung môi ete dầu hoả).
Quá trình tách sắc ký thường bao gồm 3 giai đoạn chính:
- Đưa hỗn hợp lên pha tĩnh (ví dụ đưa các sắc tố lên đầu cột canlci carbonat). Các chất được giữ trên pha tĩnh.
- Cho pha động chạy qua pha tĩnh (ví dụ: dung môi ête dầu hoả qua cột), kéo theo các chất di chuyển trên pha tĩnh với tốc độ khác nhau, tách khỏi nhau và có vị trí khác nhau trên pha tĩnh tạo thành sắc đồ. Giai đoạn này gọi là khai triển sắc ký.