6. Bố cục luận văn
1.3.2. Phương pháp sắc kí khí GC-MS
1.3.2.1. Phương pháp sắc kí
* Giới thiệu về phương pháp sắc kí
Sắc kí là một kĩ thuật vật lí và hóa lí để tách và phân tích các chất trong một hỗn hợp.
Cơ sở của quá trình sắc kí là các quá trình xảy ra trong cột tách khi mẫu được nạp vào cột sắc kí. Để thực hiện quá trình sắc kí có hai pha:
- Pha tĩnh thường ở dạng rắn hay lỏng, dưới dạng màng mỏng bám đều trên bề mặt chất mang trơ chứa trong cột sắc kí.
- Pha động: Chất phân tích và dung môi thích hợp.
Quá trình sắc kí xảy ra trong cột chính là quá trình tương tác giữa các phân tích và pha tĩnh nằm trong cột. Quá trình tương tác đó có thể theo các tính chất hóa lí nhất định, đó là sự hấp phụ, trao đổi, phân bố, rây phân tử. Tương ứng ta có tên gọi các phương pháp sắc kí: sắc kí hấp phụ dựa vào tính chất hấp phụ chất phân tích lên trên bề mặt pha tĩnh, sắc kí trao đổi dựa vào sự trao đổi ion cùng dấu giữa chất phân tích với pha tĩnh, sắc kí phân bố dựa vào sự phân bố của chất phân tích lên pha tĩnh….
Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí là quá trình sắc kí được lặp đi lặp lại nhiều lần, có thể xảy ra trên giấy, trên bản mỏng, trên cột. Do vậy, khả năng tách hoàn toàn và phân tích định lượng tương đối chính xác.
* Nguyên tắc của sự tách trong sắc kí Lực tương tác tổng hợp: ft = fa + fb + fc
Khi thực hiện quá trình sắc kí đối với một chất nhất định thì fa = const. Do đó ft = fc + fb
Trong đó: fa đặc trưng cho quá trình pha tĩnh giữ chất phân tích lại fb đặc trưng cho quá trình kéo chất phân tích ra
fc là lực rửa giải chất phân tích ra khỏi cột.
Chất phân tích bám càng chặt vào pha tĩnh thì rửa giải càng khó và ngược lại. Khả năng chất phân tích bám trên bề mặt pha tĩnh được đặc trưng bằng ái lực của chất phân tích đối với pha tĩnh, chất bám càng mạnh thì ái lực càng lớn và rửa giải càng khó. Các chất phân tích được tách và đi ra khỏi cột được ghi lại dưới dạng pic trên sắc kí đồ ngoại.
* Các đại lượng đặc trưng cho quá trình sắc kí - Sự phân bố
Tùy theo ái lực của chất phân tích mà sự phân bố các chất khác nhau, và được đặc trưng bằng hệ số phân bố Ki:
Ki = ) ( ) ( M i S i C C
Ci(S): nồng độ Ci trong pha tĩnh Ci(M): nồng độ Ci trong pha động
Ki phụ thuộc vào bản chất phân tích vào pha động, pha tĩnh. Xảy ra 3 trường hợp: phân bố lồi, phân bố lõm, phân bố tuyến tính.
Phân bố lồi, lõm xảy ra khi tín hiệu ra dưới dạng pic không cân đối, do đó không ứng dụng vào trong phân tích định lượng. Pic có cân đối hay không
phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: bản chất pha động, pha tĩnh, nồng độ chất phân tích: nồng độ chất phân tích càng nhỏ thì pic càng cân đối và ngược lại, do đó sắc kí không thể dùng được dung dịch có nồng độ lớn.
- Thời gian lưu (tRi): là thời gian kể từ khi nạp mẫu vào cột cho đến khi chất phân tích được rửa giải ra khỏi cột ở thời điểm có Cmax.
- Thể tích lưu giữ (VRi): là thể tích pha chảy qua cột kể từ lúc bơm mẫu vào cột đến khi chất phân tích được rửa giải ra khỏi cột, ứng với thời điểm có Cmax, nghĩa là tương ứng với thời điểm lưu giữ.
Đối với pha động có thể tích lưu của pha động, đối với pha tĩnh có thể tích lưu của pha tĩnh.
- Đĩa sắc kí: là lớp pha tĩnh rất mỏng có chiều cao h, h phụ thuộc vào bản chất của pha tĩnh, pha động, đường kính và độ xốp của pha tĩnh, nhiệt độ, bản chất của chất phân tích. h = 16 L . 2 2 Ri i t W
L: chiều dài cột sắc kí chứa pha tĩnh Wi: chiều dài đáy pic sắc kí
tRi: thời gian lưu
Số đĩa N =
h L
N đóng vai trò quan trọng quyết định quá trình tách có hoàn toàn hay không, số đĩa càng lớn quá trình tách càng hoàn toàn.
1.3.2.2. Sắc kí khí (GC)
* Giới thiệu phương pháp
Sắc kí khí là một trong những phương pháp quan trọng nhất hiện nay dùng để tách định lượng, xác định cấu trúc các chất, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu các chất hữu cơ.
Pha động trong GC là khí nên chất phân tích cũng phải được hóa hơi để đưa vào cột sắc kí, thường hóa hơi dưới 2500C.
Pha tĩnh có thể là chất rắn được nhồi vào cột, hay 1 màng film bám lên mặt trong của thành cột (cột mao quản).
Phương pháp này chỉ được giới hạn vào những chất có thể bốc hơi mà không bị phân hủy xác định dưới thể hơi.
Có 2 kĩ thuật phân tích:
+ Giữ cho nhiệt độ không đổi trong suốt quá trình phân tích, phương pháp này khó tách hoàn toàn.
+ Thay đổi nhiệt độ trong quá trình phân tích, phương pháp này tuy tốn thời gian nhưng triệt để.
* Máy sắc kí
Cột sắc kí: có thể là cột nhồi hay cột mao quản. Cột nhồi thường ngắn và khả năng tách không triệt để. Hiện nay, sử dụng cột mao quản. Cột mao quản có thể làm bằng đồng hay thủy tinh, dài khoảng 100 – 150 m, đường kính cột 1 mm, dưới dạng xoắn, một đầu nối với lò nung, một đầu nối với detector. Ưu điểm của phương pháp:
+ Tách được hỗn hợp phức tạp và đặc biệt là tách được các chất có cấu tạo tương tự nhau.
+ Độ tin cậy cao hơn hẳn trong việc phát hiện tạp chất. + Độ nhạy cao và giảm được thời gian phân tích. + Tiết kiệm pha động.
+ Có thể nối với máy khối phổ để xác định cấu trúc các chất.
Máy khối phổ là detector vạn năng dùng cho sắc kí khí, vì một chất bất kì nào đi qua máy sắc kí đều được chuyển hóa thành ion trong máy khối phổ. Đồng thời bản chất đặc trưng của phổ khối đồ cho máy phổ khối như là 2 detector sắc kí khí đặc trưng. Có thể ví máy sắc kí như một máy tách lí tưởng
còn phổ khối là một detector tuyệt hảo để nhận biết. Hơn nữa, giữa sắc kí khí và khối phổ có một sự tương thích cao.
1.3.2.3. Phương pháp khối phổ
* Nguyên tắc
Nguyên tắc của phương pháp khối phổ là dựa vào chất nghiên cứu được ion hóa trong pha khí hoặc pha ngưng tụ dưới chân không cao bằng phương pháp thích hợp thành những ion (ion phân tử, ion mảnh…) có số khối khác nhau, sau đó các ion này được phân tích những dãy ion theo cùng số khối (chính xác là theo cùng tỉ số khối trên điện tích ion, m/e) và xác xuất có mặt của mỗi dãy ion có cùng tỉ số m/e được ghi trên đồ thị có trục tung là xác xuất có mặt (hay cường độ vạch), trục hoành là tỉ số m/e gọi là khối phổ đồ.
Phổ khối lượng được ghi lại dưới dạng vạch hay bảng, trong đó cường độ cao nhất gọi là đỉnh cơ sở. Đỉnh ion phân tử thường là đỉnh cao nhất, tương đương với khối lượng phân tử của hợp chất khảo sát.
Phổ khối lượng không những cho phép xác định chính xác phân tử lượng, mà căn cứ vào các mảnh phân tử được tạo thành ta cũng suy ra được cấu trúc phân tử. Xác định tạo thành mảnh phụ thuộc vào cường độ liên kết tương ứng trong phân tử cũng như vào khả năng bền hóa các mảnh tạo thành nhờ các hiệu ứng khác nhau. Các mảnh có độ bền lớn sẽ ưu tiên tạo thành, các liên kết yếu dễ bị đứt nhất. Có những mảnh có khối lượng đặc trưng gọi là mảnh chìa khóa, chúng cho phép phân tích các phổ khối lượng dễ dàng.
* Các phương pháp ion hóa mẫu trong phối khổ
- Phương pháp va đập eclectron
Đây là phương pháp dùng phổ biến nhất. Mẫu chất ở dạng hơi đi vào buồng ion hóa duy trì ở áp suất 0,005 torr và 250C, ở đây có một dòng e phát ra từ catot bằng vonfram hoặc reni khi đốt nóng chuyển động vuông góc với mẫu đi về phía anot với tốc độ cao và xảy ra sự va chạm giữa chúng, biến các
phân tử trung hòa thành các ion phân tử hoặc các ion mảnh tùy thuộc vào năng lượng của dòng e.
- Phương pháp ion hóa bằng trường điện
Trong phương pháp này người ta sử dụng một điện trường rất mạnh để gây ra sự phát xạ e. Khi phân tử đi vào khoảng không của 2 điện cực đặt sát nhau trong đó có sự có mặt của điện trường cao (107-108 V/cm), nó tạo ra lực hút tĩnh điện giống như lực tĩnh điện trên các đĩa tụ điện, đủ để bứt 1e khỏi phân tử mà không truyền lượng dư nào đáng kể. Sự phân mảnh ít hoặc không xảy ra, các ion phân tử tạo thành cho các vạch phổ rất mảnh.
- Phương pháp ion hóa hóa học
Trong phương pháp này người ta cho các dòng ion dương và ion âm va chạm với mẫu để biến các phân tử trung hòa thành các ion phân tử hoặc ion mảnh. Điều khác biệt đáng lưu ý là ngoài ion phân tử tạo thành còn có những ion tựa ion phân tử (những ion có phân tử khác ion phân tử 1 đơn vị hoặc nhiều hơn), do đó phổ khối các ion hóa hóa học chứa ít các ion mảnh.
Phương pháp ion hóa hóa học có một nhược điểm chung là vắng mặt các phản ứng bẻ gãy liên kết C-C nên cho ít thông tin về khung. Phổ ion hóa hóa học rất thích hợp để phân tích các hợp chất phân cực có phân tử khối tới 1000 đơn vị. Các ion giàu quan hệ với phân tử khối và các ion mảnh đặc biệt thích hợp cho việc xác định cấu trúc.
* Bộ phận tách khối
Sau khi bị bắn phá các ion dương được tăng tốc nhờ một bản điện tích âm, lọt qua khe hẹp và từ trường, các ion này chuyển động tròn với bán kính r phụ thuộc vào khối lượng m, điện thế U của trường gia tốc và trường gia tốc và cường độ từ trường H của nam châm:
r =
eH mU
Với U, H không đổi thì r chỉ phụ thuộc vào m/e, bằng cách thay đổi từ trường hay điện trường, ta có thể thay đổi bán kính quĩ đạo chuyển động của các ion và hướng vào các khe ion có khối lượng khác nhau.
* Các hệ thống thu nhận ion (detector)
Các chùm ion đi ra từ bộ phận tách khối được thu nhận bằng kính ảnh hoặc bằng phương pháp điện. Ở các máy khối phổ hiện đại, các dữ liệu được số hóa và được thu vào băng từ hoặc trữ trong bộ nhớ của máy tính để xử lý tiếp và in ra phổ đồ biểu diễn dưới dạng phần trăm cơ sở.
* Ứng dụng của phổ khối - Xác định công thức phân tử
Ngày nay với kĩ thuật khối phổ phân giải cao cho phép đo được phân tử khối chính xác với 4, 5 con số sau dấu phẩy. Nhờ vậy có thể dùng một mình nó cũng đủ để định lượng thành phần nguyên tố của ion xác định. Ngoài ra có thể xác định công thức phân tử dựa vào cường độ tương đối của ion phân tử đồng vị xuất hiện trên phổ khối đồ.
- Xác định công thức cấu tạo
Đây là ứng dụng có ý nghĩa quan trọng trong nghiên cứu hóa học hữu cơ. Dựa vào các giá trị m/e, cường độ tương đối của các ion phân tử hay ion mảnh, ta có thể xác định chính xác công thức phân tử của nhiều hợp chất.
1.3.2.4. Phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ (GC-MS)
Cấu tạo của máy GC – MS gồm 2 phần: thiết bị sắc kí khí và thiết bị khối phổ được ghép với nhau qua bộ kết nối với mục đích loại bớt khí mang như H2, He để giảm áp suất của dòng khí mang và phân tử mẫu chất đi vào buồng ion hóa của khối phổ. Phần thiết bị sắc kí khí dùng mao quản, phần khối phổ sử dụng buồng ion hóa với bộ tách từ cực detector khối phổ.
Chương 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu
2.1.1. Thu hái nguyên liệu
Hạt quả bơ được lấy từ quả bơ ở tỉnh Đăk Lăk.
Hình 2.1. Hạt bơ
2.1.2. Xử lý nguyên liệu
Quả bơ chín sau khi thu hái xong, lấy phần hạt, rửa sạch và dùng dao bóc lấy phần vỏ của hạt.
Cắt hạt bơ thành lát mỏng và nhỏ, say mịn. Đem bột hạt quả bơ ướt sấy khô ở 800C trong tủ sấy. Thu được nguyên liệu hạt quả bơ ở hình 2.5 và tiến hành các thí nghiệm nghiên cứu.
2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu
2.2.1. Hóa chất
Để thực hiện đề tài này, chúng tôi sử dụng một số hóa chất sau:
- Các loại dung môi có độ phân tăng dần như: hexan, etyl axetat, metanol + Hexan: C6H14; có M = 86,16 g/mol; chất lỏng không màu, không tan trong nước; có khối lượng riêng D = 0,6548 g/ml; 0
nc
t = -950C; 0
s
t = 690C.
+ Etyl axetat: C4H8O2; có M = 88,11 g/mol; chất lỏng không màu; độ hòa tan trong nước 8,3g/100ml ở 200C; khối lượng riêng D = 0,897 – 0,972 g/ml;
0
nc
t = -840C; 0
s
t = 770C.
+ Metanol: CH4O; có M = 32,04 g/ml; chất lỏng không màu; khối lượng riêng D = 0,7918 g/ml; 0
nc
t = -980 – - 970C; 0
s
t = 650C. - Các dung dịch khác: H2SO4 đặc, HNO3 loãng.
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu
Bộ chiết soxhlet, bộ chưng ninh, máy đo sắc kí khí ghép khối phổ GC – MS.
Máy cô quay chân không, tủ sấy, lò nung, cân phân tích, cốc thủy tinh, bếp cách thủy, bếp điện, cốc sứ, bình định mức, bình hút ẩm…
Tách chất bằng các dung môi: n-hexan, etyllaxetat, metanol
2.3. Sơ đồ nghiên cứu
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Các phương pháp xác định một số chỉ tiêu hóa lý
2.4.1.1. Xá c đi ̣nh độ ẩm
Để xác đi ̣nh đô ̣ ẩm tiến hành sấy mẫu trong tủ sấy khoảng 80oC. Ta chọn nhiê ̣t đô ̣ sấy này vì ở nhiê ̣t đô ̣ này nước đã bay hơi ma ̣nh đồng thời không làm phân hủy các chất có trong hạt quả bơ. Tiến hành thí nghiê ̣m với 3 mẫu và lấy kết quả trung bình.
- Chuẩn bi ̣ các chén sứ có kí hiê ̣u sẵn, các chén sứ được rửa sa ̣ch và đươ ̣c sấy khô trong tủ sấy, làm nguô ̣i đến nhiê ̣t đô ̣ phòng đem cân la ̣i đến khối lươ ̣ng không đổi m0.
- Mẫu để xác đi ̣nh đô ̣ ẩm là mẫu bô ̣t, đươ ̣c trô ̣n đều và lấy ngẫu nhiên.
Các dịch chiết
Hạt quả bơ Xác định các đại lượng vật lý
Độ ẩm Hàm lượng tro Hàm lượng kim loại
Nghiên cứu phương pháp tách chất GC – MS
Thăm dò hoạt tính sinh học
Khảo sát điều kiện tách chất: Thời gian và tỉ lệ R/L
Cân lươ ̣ng mẫu chính xác m1 trên cân phân tích, cho vào các chén sứ đã đươ ̣c chuẩn bị sẵn và được sấy ở nhiê ̣t đô ̣ trên. Cứ sau 5 giờ la ̣i lấy ra để trong bình hú t ẩm cho nguô ̣i đến nhiê ̣t đô ̣ phòng rồi cân, đến khi khối lươ ̣ng mẫu và cố c không đổi m2.
- Độ ẩm của mỗi mẫu là hiê ̣u số giữa khối lượng mẫu trước và sau khi sấy m=(m1 + m0) – m2. Đô ̣ ẩm trung bình của các mẫu được tính ra % theo khố i lượng mẫu ban đầu.
Độ ẩm được tính theo công thức:
α = ( ) 100% 1 0 2 1 x m m m m
2.4.1.2. Xá c đi ̣nh hàm lượng tro
Để xác đi ̣nh hàm lượng tro và các nguyên tố vô cơ trong cơ thể đô ̣ng, thực vâ ̣t người ta thường dùng các phương pháp tro hóa mẫu.
Trong đề tài này, chúng tôi sử du ̣ng phương pháp tro hóa mẫu bằng