2.6.1. Quy trình theo dõi nồng độ carbamazepin, acid valproic và phenytoin trong trị liệu
2.6.1.1. Phương pháp đo nồng độ thuốc trong máu
Định lượng bằng phương pháp miễn dịch huỳnh quang phân cực (Fluorescence Polarization Immunoassay Assay - FPIA) trên hệ máy Centaur XP – Đức, thuốc thử là bộ Kit phân tích tự động được cung cấp bởi hãng Siemens (Đức).
Nguyên tắc:
Thuốc có đánh dấu huỳnh quang + kháng thể đặc hiệu phức hợp làm phân cực ánh sáng huỳnh quang.
Thuốc trong mẫu máu cần đo cạnh tranh làm giảm lượng phức hợp thay đổi độ phân cực của ánh sáng huỳnh quang.
Độ thay đổi tỷ lệ với lượng thuốc có trong mẫu máu.
2.6.1.2. Quy trình đo nồng độ thuốc trong máu Bước 1: lấy mẫu
Máu được lấy khi nồng độ thuốc đạt trạng thái cân bằng (5 lần T1/2). Đo nồng độ đáy: lấy mẫu ở 0-30 phút trước khi dùng liều tiếp theo. Đo nồng độ đỉnh: tùy loại thuốc và dạng bào chế, tuy nhiên không áp dụng đối với thuốc đang nghiên cứu.
Vị trí lấy mẫu: tĩnh mạch khuỷu tay và tĩnh mạch cánh tay trong. Thể tích mẫu: 2-3 mL.
– Mẫu máu (3 mL máu tĩnh mạch) sau khi lấy được cho vào ống nghiệm có chất chống đông heparin và gởi lên khoa Sinh hóa huyết học của bệnh viện.
– Ly tâm 3000 vòng/phút tách lấy huyết tương. Bước 3: Bảo quản mẫu
Huyết tương được tách ra cho vào ống nghiệm nút kín, có dán nhãn, mã hóa và được định lượng ngay hoặc bảo quản ở nhiệt độ thích hợp (-20 oC) nếu không định lượng được ngay.
Bước 4: Định lượng nồng độ thuốc Chuẩn hóa máy TDx Analyser
Tiến hành đo nồng độ thuốc trong huyết tương Ghi nhận kết quả.
Bảng 2.6. Cách lấy mẫu máu đo nồng độ cho từng thuốc nghiên cứu
Thông tin CBZ
Tổng nồng độ 4-12 μg/mL
(không gắn kết + gắn kết)
Thời điểm lấy Đo nồng độ đáy
mẫu Ngay trước liều
đầu tiên vào buổi sáng
Những trường Mẫu thử được lấy hợp không cấp 3-4 tuần sau khi
tính uống
Lấy mẫu trong trường hợp đặc biệt
Điều trị lâu dài Lấy mẫu theo dõi
mỗi 3-12 tháng
VAL PHT
50-100 μg/mL 10-20 μg/mL
Nồng độ PHT tự do: 1-2 μg/mL
Đo nồng độ đáy Đo nồng độ đáy
Ngay trước liềuNgay trước liều đầu
đầu tiên vào buổitiên vào buổi sáng
sáng
Mẫu thử được lấy Mẫu thử được lấy 7-10
2-4 ngày sau khi ngày sau khi uống
uống
Mẫu thử được lấy Đối với BN nặng
2-4 ngày sau khi Lần 1: mẫu thử được
bắt đầu điều trịlấy lần đầu tiên trong
nhằm điều chỉnh khoảng từ 2-3 ngày.
chế độ liều Lần 2: mẫu thử được lấy lần đầu tiên trong khoảng từ 3-5 ngày
sau lần 1
Nếu nồng độ thuốc ổn định từ 3-5 ngày, theo
dõi sau mỗi tuần Lấy mẫu theo dõiLấy mẫu theo dõi mỗi
2.6.2. Quy trình khảo sát tính đa hình của CYP
2.6.2.1. Phương pháp xác định đột biến CYP
Xác định vị trí đa hình gen theo phương pháp real-time polymerase chain reaction với kỹ thuật RFLP (restriction fragment length polymorphism) được chạy trên thiết bị Real-time PCR, dòng Mx3005P™ - Agilent với đoạn mồi và primer phù hợp, chạy trên máy Rotorgene 6000/Q (Corbett, Research, Qiagen) nhằm tìm các đột biến trên exon ở nhiễm sắc thể số 10 có gen mã hóa cho enzym CYP.
Nguyên tắc: kiểu gen được xác định dựa trên sự khác biệt điểm chảy đặc hiệu trên đường cong điểm chảy của gen gốc và gen đột biến, theo các bước sau:
Thực hiện biến tính mẫu thuốc thử và hoạt hóa enzym Khuếch đại đoạn ADN đích bằng phương pháp PCR
Phân tích đường cong nóng chảy xác định sản phẩm PCR từ ADN đích Làm lạnh hệ thống
2.6.2.2. Quy trình lấy mẫu máu ban đầu và bảo quản
Vị trí lấy mẫu: tĩnh mạch khuỷu tay và tĩnh mạch cánh tay trong Thể tích mẫu: 4 mL mẫu máu tươi (ổn định trong EDTA) được bảo quản ở nhiệt độ phòng (18-25 oC) trong 2-3 giờ hoặc ở nhiệt độ 4-8 oC trong vòng 24 giờ, bảo quản mẫu trong vòng 1 tháng (ở -20 oC) và 1 năm (ở -80 oC).
- Ly tâm tách lấy huyết tương từ máu và bảo quản lạnh trong vòng 1 tháng (ở - 20 oC) và 1 năm (ở -80 oC).
2.6.2.3. Tách chiết ADN bộ gen từ mẫu
Nguyên tắc: kết hợp các chất ly giải hiệu quả vật liệu ban đầu, không hoạt hóa các DNases, protein trong dung dịch ly giải được phân hủy với proteinase K. ADN tự do được gắn vào màng lọc “RTA Spin Filter”. Các chất gây nhiễm được loại bỏ bằng nhiều bước rửa và ADN tinh sạch có thể được hoà tan với một lượng nhỏ đệm rửa “Elution Buffer” và sử dụng ngay hoặc bảo quản ở -80°C. Sử dụng bộ công cụ chiết tách Invisorb® Spin Universal Kit.
Các bước thực hiện: Bước 1: ly giải mẫu
Mẫu được ly giải trong điều kiện biến tính với nhiệt độ tăng dần. Với điều kiện biến tính mạnh có sự hiện diện của proteinase K và đệm ly giải “Lysis Buffer HL”, tế bào bị phá vỡ dễ dàng và các DNase bị bất hoạt ngay lập tức, do đó, ADN mẫu không bị ảnh hưởng. Lượng ARN mang (carrier ARN) được thêm để tăng khả năng thu hồi ADN mẫu, vì vậy một lượng ADN mẫu nhỏ cũng có thể được tinh sạch. “Carrier ARN” cũng ổn định acid nucleic trong mẫu với nồng độ acid nucleic rất nhỏ.
Bước 2: gắn mẫu vào màng lọc RTA Spin Filter
Thêm đệm gắn (Binding Buffer HL) để tối ưu hoá việc gắn ADN mẫu vào màng RTA Spin Filter.
Sau đó, dung dịch đã ly giải sẽ được đưa lên màng RTA Spin Filter và DNA mẫu sẽ gắn vào bề mặt của màng RTA Filter, trong khi đó, phần dịch sau ly giải sẽ đi qua màng nhờ ly tâm.
Bước 3: rửa sạch màng, loại bỏ các chất gây nhiễm và ethanol Các chất tạp nhiễm được rửa sạch bằng dung dịch rửa (Wash Buffer I và Wash Buffer II), trong khi ADN mẫu vẫn còn được gắn trên màng RTA Spin Filter. Bước rửa được lặp lại nhiều lần đảm bảo các chất gây nhiễm và ức chế enzym được loại bỏ một cách hiệu quả.
Bước 4: tinh sạch ADN
Hòa tan ADN tinh sạch từ màng: ADN mẫu có độ tinh sạch cao được hoà tan khỏi màng bằng đệm rửa (Elution Buffer). ADN mẫu thu được có thể sử dụng cho các ứng dụng tiếp sau.
2.6.2.4. Xác định đột biến gen bằng phương pháp real-time PCR
Sử dụng mẫu ADN đã tách chiết để xác định kiểu gen theo bộ kit (Genomic column DNA Express và SaMag Blood DNA Extraction Kit) được cung cấp từ Ý (Sacace Molecular Genetics).
Nguyên tắc: thực hiện việc khuếch đại một trình tự ADN đích bằng phản ứng real-time PCR từ các mẫu DNA người (phương pháp TaqMan ).
Phản ứng PCR hoạt động với các mồi quanh đột biến, cũng như hai probe huỳnh quang, một probe đặc hiệu cho alen thường (hoang dại) và một probe đặc hiệu cho alen đột biến. Các probe được gắn với một chất nhuộm huỳnh quang ở đầu 5’. Huỳnh quang được phân tích trong phản ứng real time hoặc ở điểm kết thúc, cho phép phân biệt các kiểu gen có thể có (đồng hợp tử bình thường, dị hợp tử, đồng hợp tử đột biến).
+ Khuếch đại đoạn gen chứa các đa hình đơn nucleotide (single nucleotide polymorphism - SNPs) bằng phương pháp PCR:
Kiểu gen CYP được xác định bởi trình tự các alen theo kỹ thuật real-time PCR sử dụng bộ kit (CYP3A5 (G6986A) SNP–Screen - được cung cấp từ Ý (Sacace Molecular Genetics) với đoạn mồi phù hợp.
Bảng 2.7. Đặc điểm trình tự gen đoạn mồi các CYP
Gen Đoạn gen – độ dài Trình tự mồi
CYP3A5*3 G 6986 A Mồi xuôi:
rs776746 5’- GGCAACATGACTTAGACAG-3’;
(121 bp) Mồi ngược:
5’- GGTCCAAACAGGGAAGAAATA - 3’ CYP2C9*2 Arg 144 Cys Mồi xuôi : 5’-biotin-
CGT 144 TGT GTATTTTGGCTTGAAACCCATA-3’
rs1799853 Mồi ngược: 5’-
GGCCTTGGTTTTTCTCAACTC-3’
CYP2C9*3 Ile 359 Leu Mồi xuôi :
ATT 359 CTT 5’-biotinTGCACGAGGTCCAGAGGTAC-3’
rs1057910 Mồi ngược:
Để có quy trình nhân dòng đoạn gen chứa các SNP đặc hiệu và ổn định, chúng tôi xác định nhiệt độ gắn mồi tối ưu, nồng độ mồi tối ưu, nồng độ ADN tối ưu trong phản ứng.
Các thành phần trong phản ứng PCR với thể tích phản ứng là 25 µl:
Thành phần Thể tích
Taq Mix 12,5 µl
Oligo Mix 7,5 µl
Cho một trong 3 ADN mẫu sau:
- ADN mẫu bệnh 5 µl
- ADN chứng dương 5 µl
- ADN chứng âm thay bằng nước 5 µl Tổng thể tích phản ứng 25 µl Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau:
94oC 94oC 72oC 30 s 15 s 60oC 30 s 1 ph 40 chu kì 72oC 2 ph 4oC
Biểu đồ 2.1. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
+ Phân tích kết quả PCR:
Các biểu đồ khuếch đại được hiển thị trên màn hình Amplification Plot. Kết quả phát hiện các SNP của quá trình real time PCR được mở bằng phần mềm MxPro qPCR, qua đó xác định kiểu gen của BN.
2.6.3. Quy trình quy trình xét nghiệm gen HLA - B
Quy trình lấy mẫu máu và quy trình tách chiết ADN bộ gen từ mẫu được thực hiện như đã mô tả trong mục 2.5.2 (Quy trình khảo sát tính đa hình của của CYP).
Nguyên tắc: sự bắt cặp đặc hiệu giữa giữa đầu dò ADN (probe) trên các vi hạt (microbead) với sản phẩm ADN của mẫu xét nghiệm đánh dấu bằng huỳnh quang, trong đó các đầu dò ADN được thiết kế đặc hiệu cho từng alen HLA ở độ phân giải cao (High resolution). Tùy theo mật độ huỳnh quang tương ứng, hệ thống Luminex đọc và xác định được tên đầu dò đã gắn với chuỗi DNA của mẫu và kiểu gen HLA tương ứng.
Mỗi vi hạt được thiết kế sẵn sao cho chúng gắn kết với các đầu dò đã biết trước trình tự và một loại phẩm nhuộm. Phẩm nhuộm này có thể được phát hiện bằng ánh sáng huỳnh quang có cường độ nhất định. Trong phương pháp này, khoảng 100 vi hạt khác nhau đã được sử dụng. Tương ứng với đó là khoảng 100 loại đầu dò và khoảng 100 mức cường độ ánh sáng huỳnh quang khác nhau.
Mẫu ADN của BN cũng được gắn với một loại phẩm nhuộm khác. Nếu có sự bắt cặp đặc hiệu giữa ADN của BN và đầu dò, hai loại phẩm nhuộm trên sẽ phát tín hiệu bởi kích thích của hai loại ánh sáng lazer khác nhau.
Khi biết được loại vi hạt nào bắt cặp đặc hiệu được với mẫu ADN của BN, lúc đó có thể xác định được kiểu gen của BN vì trình tự của đầu dò đã được thiết kế từ trước.
Các bước thực hiện:
Bước 1: Thiết lập phản ứng PCR để khuếch đại số lượng đoạn gen HLA từ mẫu ADN toàn phần.
Bước 2: Ly giải sản phẩm khuếch đại ở bước 1 từ chuỗi kép ADN thành chuỗi đơn ADN.
Bước 3: Trộn sản phẩm của bước 2 vào hỗn hợp các vi hạt để tạo sự bắt cặp đặc hiệu.
Bước 4: Trộn sản phẩm của bước 3 dung dịch SAPE (surelight streptavidin-R-phycoerythrin), để giúp các phẩm nhuộm có thể phát tín hiệu huỳnh quang dưới kích thích của ánh sáng la-ze.
Bước 5: Chuyển sản phẩm ở bước 4 vào đĩa 96 giếng với bộ Kit gồm mồi ADN (primer) đặc hiệu HLA, hệ đệm D - mix và đặt vào hệ thống Luminex, Bio Plex® của hãng Bio-Rad. Đọc kết quả từ phần mềm máy tính. 2.7. Phương pháp phân tích số liệu
- Tất cả dữ liệu được lưu trữ và xử lý bằng phần mềm thống kê SPSS phiên bản 25.0 (số đăng ký: 1975-01566-C) và phần mềm R phiên bản 3.6.1.
-Dữ liệu được điều chỉnh các sai sót do nhập liệu.
- Dùng kiểm định Kolmogorov–Smirnov (khi số lượng mẫu trên 50) hoặc kiểm định Shapiro–Wilk (khi số lượng mẫu dưới 50) để kiểm tra các biến liên tục có phân phối chuẩn hay không.
- Mô tả các đặc điểm của BN bằng trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) đối với các biến số liên tục có phân phối chuẩn, bằng trung vị (tứ phân vị thứ nhất (Q1)-tứ phân vị thứ ba (Q3)) đối với biến số liên tục không có phân phối chuẩn, bằng tỷ lệ
%(khoảng tin cậy 95%) đối với các biến số phân loại (categorical variables).
-Đối với các biến định danh, sự khác biệt giữa các nhóm dân số được khảo sát bằng phép kiểm Chi bình phương. Khi có một giá trị ni, ni’ < 5, chúng tôi thực hiện phép kiểm chính xác Fisher.
- Đối với các biến liên tục, sự khác biệt giữa hai nhóm dân số được khảo sát bằng phép Independent T-Test (phân phối chuẩn) hoặc phép kiểm Mann– Whitney (không có phân phối chuẩn). Sự khác biệt giữa ≥ 3 nhóm dân số được khảo sát bằng phép kiểm phương sai một yếu tố One-way ANOVA (phân phối chuẩn) hoặc phép kiểm Kruskal–Wallis (không có phân phối chuẩn).
-Phân tích mối tương quan được tính toán bằng các hệ số tương quan Pearson và Spearman và hồi quy tuyến tính được sử dụng để phân tích mối liên hệ giữa những yếu tố liên quan (giới, tuổi bệnh nhân, loại thuốc, liều dùng, kiểu gen, bệnh nền, tương tác thuốc) và nồng độ thuốc trong huyết tương.
2.8. Đạo đức trong nghiên cứu
Thiết kế nghiên cứu quan sát mô tả, không tác động thay đổi điều trị chuẩn theo phác đồ điều trị của BN, do vậy nghiên cứu đã được sự chấp thuận của Hội đồng Y đức (Quyết định số 23/CN-HĐYĐ cấp ngày 13/10/2015 của bệnh viện Nhân dân Gia Định)
Người bệnh tham gia nghiên cứu được giải thích chi tiết và đồng ý tham gia nghiên cứu, thể hiện bằng văn bản khi ký tên vào phiếu đồng ý tham gia nghiên cứu.
Người bệnh có quyền rút khỏi nghiên cứu bất kỳ lúc nào và vẫn được chăm sóc sức khỏe y tế bình đẳng tại bất kỳ cơ sở y tế nào.
Toàn bộ các chi phí của người bệnh: khảo sát gen và định lượng nồng độ thuốc trong máu trong vòng 12 tháng được miễn phí.
Thông tin về người bệnh được bảo mật tuyệt đối và chỉ phục vụ mục tiêu nghiên cứu khoa học.
Các biến cố có thể xảy ra trong quá trình nghiên cứu (có hay không liên quan đến nghiên cứu) đều được ghi nhận, được giải thích, thông báo công khai đến người bệnh. Đội ngũ nghiên cứu có nhiệm vụ phát hiện và xử trí thích hợp các tình huống bất lợi đối với BN trong quá trình theo dõi.
Chương 3. KẾT QUẢ
Nghiên cứu được thực hiện từ 01/2016 đến 12/2018 sau khi tiếp cận tất cả BN có chẩn đoán động kinh và có sử dụng thuốc chống động kinh, chúng tôi tuyển chọn được 208 BN trong đó có 141 BN thỏa tiêu chuẩn nghiên cứu.
3.1. Tính đa hình gen và tỷ lệ các kiểu hình của CYP3A5, CYP2C9 trên bệnh nhân động kinh
3.1.1. Đặc điểm của bệnh nhân trong nghiên cứu
3.1.1.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân trong nghiên cứu
Một số đặc điểm chung của bệnh nhân trong nghiên cứu được trình bày trong Bảng 3.1 và Bảng 3.2.
Bảng 3.1. Đặc điểm chung của bệnh nhân trong nghiên cứu (N=141)
Đặc điểm Tần suất (n) Tỷ lệ (%) Giới tính Nữ 59 41,8 Nam 82 58,2 Nhóm tuổi Dưới 60 tuổi 103 73,1 Trên 60 tuổi 38 26,9
Tiền sử động kinh trong gia đình
Có 12 8,5
Không 129 91,5
Thời gian điều trị
Dưới 5 năm 68 42,2
Từ 5 năm đến 10 năm 24 17,0
Trên 10 năm 49 40,8
Phân loại hội chứng động kinh
Động kinh vô căn 11 7,8
Động kinh triệu chứng 117 83,0
Động kinh căn nguyên ẩn 13 9,2
Yếu tố khởi phát Có 75 53,2 Không 66 46,8 Bệnh lý mắc kèm 0 64 45,4 1 26 18,4 2 25 17,8 Trên 2 26 18,4
Tuổi trung bình của các bệnh nhân tham gia nghiên cứu là 50,5 ± 15,4 (tuổi), trung vị 54 (38 - 61). Trong đó, BN trẻ tuổi nhất là 16 tuổi và BN lớn tuổi nhất là 81 tuổi. Thời gian điều trị chủ yếu nằm trong khoảng thời gian dưới 10 năm (chiếm 59,2%). Hội chứng động kinh chủ yếu được ghi nhận là động kinh triệu chứng xuất hiện ở 83% và có yếu tố khởi phát chiếm trên 50% dân số mẫu. Đa phần BN có thêm bệnh lý mắc kèm (chiếm 54,6%) với bệnh kèm chủ yếu là di chứng do tai biến mạch máu não (40 BN; 28,4%). Các bệnh kèm khác bao gồm rối loạn lipid máu, thiểu năng tuần hoàn não.
Bảng 3.2. Đặc điểm cận lâm sàng của bệnh nhân trong nghiên cứu (N = 141)
Đặc điểm Trung bình ± ĐLC Thấp nhất Cao nhất
Trung vị (Q1 - Q3) Cân nặng (kg) 58,3 ± 8,6 41 83 BMI (kg/m2) 22,1 ± 2,6 16,7 31,1 Mức lọc cầu thận (ml/phút) 74,1 ± 20,0 45 132 Albumin máu 40,3 ± 5,2 30,5 48,0 AST 23,1 (19,0 - 27,5) 13,5 86,8 ALT 21,0 (14,7 - 30,1) 6,4 99,2