3. Chuẩn bị mẫu thử
6.3. Định lƣợng Protein Phƣơng pháp Stutzer – Barnstein
Phƣơng pháp Kjeldahl định lƣợng ni tơ toàn phần, nghĩa là ni tơ của protid thô (gồm ni tơ của protein, peptid, polypeptid và nitơ của các chất phi protid).
Các phƣơng pháp định lƣợng protein hòa tan gồm 3 loại: - Các phƣơng pháp thƣờng.
- Các phƣơng pháp bán vi lƣợng. - Phƣơng pháp vi lƣợng.
Các phƣơng pháp này dựa vào việc tách và kết tủa protein thật ra khỏi chất thử, rồi định lƣợng ni tơ trong kết tủa protid theo phƣơng pháp Kjeldahl.
Ở đây ta chỉ nghiên cứu phƣơng pháp thƣờng để định lƣợng protein.
Phƣơng pháp Stutzer – Barnstein: 6.3.1. Nguyên lý:
Chiết protein từ thực phẩm bằng nƣớc. Kết tủa protein ở dịch chiết bằng CuSO4. Tách kết tủa, rửa sạch và định lƣợng ni tơ toàn phần trong kết tủa bằng phƣơng pháp Kjeldahl.
6.3.2. Dụng cụ, vật liệu, thuốc thử:
- Dụng cụ, vật liệu thông thƣờng của phòng thí nghiệm - Dung dịch CuSO4: - CuSO4 60 g - Nƣớc cất vừa đủ 1000ml - Dung dịch NaOH: - NaOH 12,5 g - Nƣớc cất vừa đủ 1000ml
- Dung dịch Kali ferocyanur:
- Kali ferocyanur 5 g - Nƣớc cất vừa đủ 100ml - Dung dịch BaCl2: - BaCl2 10 g - Nƣớc cất vừa đủ 100ml 6.3.3. Cách tiến hành:
Cân thật chính xác khoảng 10g chất thử đã nghiền nhuyễn, cho vào cốc thủy tinh với 50 ml nƣớc cất. Đun sôi.
Cho vào dịch chiết 25 ml dung dịch CuSO4 và tiếp theo, vừa khuấy vừa cho từ từ 25 ml dung dịch NaOH. Sau khi để kết tủa lắng yên, nƣớc ở phía trên phải có phản ứng kiềm (thử với giấy quỳ) và phải có thừa Cu++ (phản ứng lên màu nâu với Kali ferocyanur). Gạn lọc bỏ lớp nƣớc trên qua giấy lọc. Rửa tủa bằng nƣớc cất, và gạn lọc bỏ lớp nƣớc trên qua giấy lọc. Khi nào nƣớc lọc không cho phản ứng dƣơng tính với Kali ferocyanur nữa (hết Cu++), hoặc với Bari Clorur (hết SO4--) đổ hết cả tủa lẫn nƣớc trên giấy lọc. Tráng cốc nhiều lần với nƣớc cất và đổ hết lên giấy lọc.
Để ráo nƣớc, cho kết tủa protein cùng với giấy lọc vào bình Kjeldahl và tiến hành định lƣợng ni tơ trong kết tủa theo phƣơng pháp Kjeldahl.