Quy trình thí nghiệm xác đinh ngưỡng độc câp tính EC50 của chì đối với M. dubia
Quy trình xác định giá trị EC50 trong phòng thí nghiệm được thực hiện theo hướng dẫn của cục bảo môi trường Mỹ (EPA) [130].
Bước 1: Chuẩn bi dung dịch nền. Dung dịch nền được chuẩn bị là dung dịch có độ cứng trung bình: Pha 20 lít dung dịch nền có nồng độ các chất như sau: Ca2+ 3,49mg/L; Mg2+ 3,1 mg/L; Na+ 13,7 mg/L; Na+ 13,7 mg/L; K+ 14 mg/L, SO42 2,5 mg/L; Cl- 5,9 mg/L bằng dung dịch nước deion. Dung dịch được pha và ổn định trước khi thí nghiệm. Khi tiến hành thí nghiệm tính toán độc học cấp tính của chất ô nhiễm đối với sinh vật thử nghiệm, yêu cầu dải nồng độ chì phơi nhiễm lựa chọn cần tạo được những phản ứng ở nhiều cấp độ khác nhau từ mức gây phản ứng nhỏ, phần trăm số con phản ứng nhỏ hơn 50% tổng số con tham gia phơi nhiễm tới nồng độ gây phản ứng lớn nhất, phần trăm số con phản ứng trên 50% số lượng cá thể tham gia phơi nhiễm.
Bước 2: Chì nitơrat (PbNO3) được pha vào dung dịch nền với nồng độ chì khác nhau từ 50 µg/L đến 1500µg/L. Trước khi thí nghiệm, pH của dung dịch được điều chỉnh 7,8 và ổn đinh trước 30 phút trước khi tiến hành thí nghiệm.
Bước 3: Moina dubia cóđộ tuổi nhỏ hơn 24 giờ tuổi được bắt vào các cốc có nồng độ chì khác nhau. 10 con phơi nhiễm 1 nồng độ.
Thí nghiệm được lặp lại 4 lần.
Bước 4: Phơi nhiễm sinh vật trong 24 giờ với thời gian chiếu sáng 12 giờ tối: 12 giờ sáng. Nhiệt độ phơi nhiễm ổn định là nhiệt độ phòng 24oC. Kết quả số con phản ứng được ghi lại sau khi phơi nhiễm 24 giờ. Các hành vi phản ứng của Moina dubia khi phơi nhiễm chì được thực hiện theo hướng dẫn của US EPA. Chiếu luồng ánh sáng mạnh qua dung dịch chứa M. dubia. Nếu M. dubia bị bất hoạt sau 5 giây chiếu sáng thì được coi là sinh vật có phản ứng với phơi nhiễm chì.
47
Hình 2.4 Thí nghiệm tìm giá trị độc cấp tính EC50 của chì đối với M.dubia
Quy trình thí nghiệm xác đinh ngưỡng độc câp tính EC50 của chì đối với M. dubia trên nước nền tự nhiên hồ Hà Nội phục vụ hiệu chỉnh mô hình
Nước hồ sau khi thu đựng trong chai nhựa kín màu đem đậy nắp được chuyển vào phòng thí nghiệm và lọc qua giấy lọc 0.45 µm. Nước sau khi lọc xong được đem đi xét nghiệm các nồng độ các chất cơ bản như pH, BOD, Ca2+, Mg2+, Na+, K+, Cl-, Pb. Sau đó nước được bảo quản lạnh cho đến khi làm thí nghiệm độc cấp tính EC50.
Trước khi tiến hành các bước xác định ngưỡng độc cấp tính của chì đối với
M. dubia, nước hồ tự nhiên được đưa từ nơi bảo quản lạnh ra ngoài để nhiệt độ phòng. Sau đó với mỗi mẫu nước hồ được bổ sung thêm Pb2+ nồng độ 50µg/l – 1500 µg/l pH sẽ được điều chỉnh về pH ban đầu trước khi pha chì của mỗi mẫu nước hồ. Sau khi ổn định pH và ổn định nồng độ chì đã pha, các cá thể M. dubia có độ tuổi nhỏ hơn 24 giờ tuổi được bắt vào các nồng độ dung dịch khác nhau. 10 cá thể được bắt vào 1 nồng độ. Các cá thể M. dubia được cho ăn Chlorela vulgaris
trước khi làm thí nghiệm
Các thí nghiệm được phơi nhiễm trong môi trường ổn định về ánh sáng thời gian chiếu sáng 12 giờ tối: 12 giờ sáng, cường độ chiếu sáng <1000 lux, nhiệt độ phòng 24oC. Số cá thể phản ứng được ghi lại sau khi phơi nhiễm 24 giờ. Các ngưỡng hành vi phản ứng của M. dubia khi phơi nhiễm chì được thực hiện theo hướng dẫn của US EPA. Việc tính toán các giá trị EC50 được thực hiện theo quy
48
trình xử lý số liệu và tính toán giá trị EC50 . Các thí nghiệm được thực hiện lần lượt theo mỗi hồ để tìm được giá trị EC50 của từng hồ. Thực hiện thí nghiệm độc học cấp tính của chì trên nền nước tự nhiên theo hướng dẫn của OECD số 202 [131].
Quy trình xử lý số liệu và tính toán gia trị EC50 của chì đói với M. dubia
Việc tính toán giá tri EC50 được tính toán từ dữ liệu thô nhờ đường cong đáp liều lượng- bằng cách sử dụng các phép tính đơn giản. Phương pháp đơn giản nhất dựa trên tính toán trong định lí hệ số góc tam giác như hình sau: Sử dụng số liệu thô và biểu diễn trên đồ thị đường cong như hình 2.4. Chọn bất kì hai điểm bất kì trên đường cong có tọa độ điểm 1(XC, YB), điểm 2 (XA, YD) các điểm A, B, C và D là vị trí tọa độ tham chiếu lần lượt của 1 và điểm 2 trên trục tung và trục hoành của đồ thị. Ta cần xác định tọa độ của điểm EC50(XEC50, YEC50).
Hình 2.5 Tính toán giá trị EC50 dựa vào đường cong đáp ứng liều lượng Trong đó: x và x1 lần lượt là khoảng cách từ D tớiC và XEC50.
y à y1lần lượt là khoảng cách từ A tới YEC50 và B
Dựa vào công thức hệ số góc của phương trình ta có phương trình sau:
1 1 y x y x (2.1) Vì thế ta có 1 1 y *x x y (2.2) (2.3) 1 50 EC Dx (2.4) xDC (2.5) Trong đó 1 50 (x x ) EC C
49 y= A-B y1=A- 50%max 1 (A 5 0 % m a x ) * x ) x y Từ phương trình (4), có EC50 = D – x1 50 (A 50% max) * x) EC D y (2.6)
Tuy nhiên trên thực tế, để phục vụ việc tính toán nhiều bộ số liệu cùng một lúc, các nhà lập trình đã phát triển cách tính theo phương trình trên thành phần mềm tính toán EC50. Trong nghiên cứu này, giá trị EC50 thực hiện tính theo các công thức trên nhưng được viết dưới dạng mô hình tính theo thuật toán probit. Mô hình tính EC50 là Medcalc. Các thuật toán mô hình xuất bản trên website: https://www.mdcalc.com/