b ng công cụ tin sinh
3.2.1Kết quả tách chiết DNA tổng số từ các mẫu Tế tân
Tách chiết DN là bƣớc đầu tiên cho các thí nghiệm tiếp theo. Để có đƣợc các kết quả tốt ở các bƣớc PCR và giải trình tự, chất lƣợng của DNA tổng số đóng một vai trò rất quan trọng. Đặc điểm của một dải DNA tốt là rõ ràng, nguyên vẹn và ít đứt gãy thành các băng mờ có kích thƣớc thấp (xem hình 3.5). Phƣơng pháp để đánh giá độ tinh khiết phổ biến nhất là tỷ số giữa độ hấp thụ ở bƣớc sóng 260 nm trên độ hấp thụ ở bƣớc sóng 280 nm. DNA chất lƣợng tốt sẽ có tỷ lệ A260/A280 trong khoảng 1,8 - 2,0. Thông thƣờng, kết quả thấp hơn 1,8 cho thấy có sự chƣa tinh sạch do lẫn protein, trong khi sự tạp nhiễm RN thƣờng sẽ cho kết quả cao 2,0. 260 / 230 đƣợc sử dụng làm thƣớc đo thứ cấp về độ tinh khiết của axit nucleic.
Trong nghiên cứu này, DNA tổng số của bốn mẫu lá Tế tân (LC: mẫu Lai châu, BPS: mẫu Bắc Phong Sinh, TD: mẫu Tam Đảo, YT: mẫu Yên Tử) đƣợc tách chiết b ng phƣơng pháp CT B nhƣ đã đề cập. B ng cách sử dụng đệm chiết CT B đã có thay đổi để phù hợp với mẫu nghiên cứu, kết hợp với loại bỏ protein và tạp chất b ng hỗn hợp dung dịch phenol: chloroform: isoamylalcohol (25:24:1), kết tủa với CH3COONa 3M, EtOH 100 % và RNase, DNA tổng số đã đƣợc tách thành công và có chất lƣợng tốt, thể hiện qua kết quả điện di trên gel agarose. Hình 3.5 cho thấy băng DN tổng số rõ ràng, không có vệt gãy và RN đã bị loại bỏ. Sau đó, phép đo OD đƣợc thực hiện b ng cách sử dụng máy đo quang phổ Nanodrop để xác định nồng độ của DNA và kiểm tra lại độ tinh khiết của DNA tổng số. Trong quá trình tách
chiết DNA của các mẫu Tế tân cho thấy do lá thân của cây thƣờng chứa nhiều hợp chất thứ cấp nhƣ tinh dầu và hợp chất khác nên có gây khó khăn khi chƣa tinh sạch DNA sau vài lần đầu tiên. Sau đó, chúng tôi đã lặp lại việc kết tủa và chiết với chloroform thì chất lƣợng DN đã sạch hơn nhiều. Kết quả cho thấy, các mẫu đều có tỉ lệ A260 /A280 n m trong khoảng cho phép 1,8 - 2,0. Nồng độ của các mẫu DN là cũng n m trong ngƣỡng khá cao nhƣ vậy các mẫu đủ điều kiện để sử dụng cho các bƣớc tiếp theo trong nghiên cứu.
Hình 3.5: Kết quả điện di DNA tổng số của bốn mẫu Tế tân
Chú thích: M: thang DNA chuẩn, LC: DNA mẫu Lai Châu, BPS: DNA mẫu Bắc Phong Sinh, TD: DNA mẫu Tam Đảo, YT: DNA mẫu Yên Tử.
3.2.2 Kết quả khuếch đại các đ ạn chỉ hị NA b ng PCR
Trong nghiên cứu này, các đoạn mồi ITS1, ITS2, matK và rpoC đƣợc sử dụng để khuếch đại các đoạn gen tƣơng ứng của 4 mẫu Tế tân quan tâm. Kết quả điện di các sản phẩm PCR (Xem hình 3.6) cho thấy, ITS1 có băng ở vị trí chính xác (khoảng 300 bp), tuy nhiên có xuất hiện sản phẩm phụ là một băng không đặc hiệu với kích thƣớc trên 500 bp phía trên băng đúng kích thƣớc, do đó cần tiến hành tinh sạch qua gel agarose để thu đƣợc đoạn gen
ITS1 mong muốn. Các chỉ thị còn lại cho băng đặc hiệu ở kích thƣớc khoảng
400 bp, 800 bp và 500 bp, tƣơng ứng với lần lƣợt ITS2, matK và rpoC nhƣ dự đoán khi thiết kế mồi nhân gen. Kết quả này cũng tƣơng đồng ở cả 3 mẫu nghiên cứu còn lại, cho thấy kết quả thiết kế mồi đã thành công. Từ đó, có thể
kết luận r ng các đoạn mồi đƣợc thiết kế đã khuếch đại chính xác các đoạn chỉ thị nhƣ kì vọng từ DNA tổng số của 4 mẫu Tế tân.
Hình 3.6: Kết quả điện di các sản phẩm PCR
Chú thích: a) Chỉ thị nhân; b) Chỉ thị lục lạp
LC: DNA mẫu Lai Châu, BPS: DNA mẫu Bắc Phong Sinh, TD: DNA mẫu Tam Đảo, YT: DNA mẫu Yên Tử.
3.2.3 Kế uả inh ạch các sản phẩm PCR khuếch đại các đ ạn chỉ thị DNA
a) Tinh sạch trực tiếp sản phẩm PCR
Đối với các chỉ thị ITS2, rpoC và matK, tuy đã thu đƣợc băng chính xác nhƣ kì vọng, nhƣng cần tinh sạch lại nh m loại bỏ các sản phẩm dƣ thừa hay mồi còn tồn tại trong sản phẩm PCR nhƣ đã quan sát đƣợc trên ảnh điện di. Kết quả các sản phẩm tinh sạch qua kit E.Z.N.A®Cycle Pure Kit (Omega Bio-tek) cho thấy cả 3 mồi đều cho một băng có kích thƣớc chính xác, nồng độ cao cũng nhƣ không còn các sản phẩm dƣ thừa có thể ảnh hƣởng xấu tới chất lƣợng giải trình tự (Xem hình 3.7).
Đối với sản phẩm PCR của mồi ITS1 ở các mẫu, do băng chƣa thực sự đặc hiệu nên chúng tôi đã sử dụng bộ kit GeneJET Gel Extraction Kit (Thermo Scientific) để tiến hành tinh sạch qua gel agarose, nh m thu đƣợc một băng ITS1 duy nhất ở đúng kích thƣớc. Sau khi điện di toàn bộ sản phẩm PCR và thu phần gel chứa băng ITS1 duy nhất, các bƣớc làm tan gel và tinh sạch đƣợc thực hiện nhƣ đã trình bày ở phần phƣơng pháp. Kết quả tinh sạch đƣợc kiểm tra lại thông qua điện di gel agarose 0,8%, một lần nữa cho thấy chất lƣợng DN cao, đặc hiệu và không có sản phẩm phụ tƣơng tự với sản phẩm tinh sạch (Xem hình 3.7).
Các sản phẩm tinh sạch b ng hai phƣơng pháp đều cho thấy chất lƣợng cao, kích thƣớc chính xác và có thể tiếp tục tiến hành giải trình tự.
Hình 3.7: Kết quả điện di sản phẩm tinh sạch các mẫu Tế tân
Chú thích: a) Chỉ thị nhân b) Chỉ thị lục lạp
LC: DNA mẫu Lai Châu, BPS: DNA mẫu Bắc Phong Sinh, TD: DNA mẫu Tam Đảo, YT: DNA mẫu Yên Tử.
3.2.4 Kế uả ác định ình ự các đ ạn NA a c ding
Trình tự nucleotide của các đoạn chỉ thị của bốn mẫu Tế tân đƣợc xác định b ng phƣơng pháp Sanger, cho kết quả chất lƣợng giải trình tự cao. Công đoạn hiệu chỉnh các trình tự thô đã đƣợc thực hiện trên phần mềm Chromas để loại bỏ tín hiệu nhiễu ở một số peak. Sau khi chỉnh sửa các peak chất lƣợng thấp cũng nhƣ loại bỏ các đoạn nucleotide nhiễu ở hai đầu của mỗi trình tự, cả 4 mẫu đều cho thấy chất lƣợng giải trình tự khá tốt với kích thƣớc không thay đổi quá nhiều so với kích thƣớc dự kiến ban đầu, cũng nhƣ số lƣợng peak không xác định rất thấp. Sau khi loại bỏ vùng nhiễu 2 đầu trình tự, độ dài các trình tự là 240 bp, 339 bp, 820 bp và 474 bp, lần lƣợt tƣơng ứng với ITS1, ITS2, matK và rpoC. Kích thƣớc các trình tự không giảm quá nhiều so với độ dài dự kiến ban đầu của các chỉ thị, cho thấy chất lƣợng giải trình tự tốt và số lƣợng nucleotide bị nhiễu không quá cao. Điều này một lần nữa khẳng định các bƣớc thiết kế mồi, khuếch đại và tinh sạch đều đƣợc thực hiện chính xác. Thông qua các kết quả ở một số mẫu ví dụ dƣới đây (Xem hình 3.8), thấy đƣợc chất lƣợng giải trình tự chính xác và có sự ổn định cao, có thể sử dụng cho các phân tích tiếp theo.
a)
c)
d)
Hình 3.8: Kết quả giải trình tự và một số vị trí đa hình của các mẫu Tế tân
3.2.5 Kế uả h n ch đánh giá đa dạng di u ền các ẫu nghiên cứu dựa ên NA a c ding
Các trình tự tƣơng đồng trong chi Asarum L. đƣợc thu thập từ cơ sở dữ liệu GenBank thông qua công cụ BLASTn và sắp xếp thẳng hàng b ng công cụ BioEdit để so sánh sự khác biệt giữa các loài trong chi này. Bƣớc sắp xếp thẳng hàng đƣợc thực hiện bởi ClustalW trên phần mềm Bioedit. Phân tích này bao gồm 12 trình tự đối với mỗi chỉ thị: 4 trình tự từ mẫu thu thập trong nghiên cứu, 7 trình tự tham chiếu có độ tƣơng đồng cao nhất và 1 trình tự outgroup đƣợc thu thập từ GenBank. Sự tƣơng đồng trong các trình tự cho thấy sự bảo thủ vốn có ở các loài có quan hệ gần gũi, tuy nhiên ở từng chỉ thị, vẫn xuất hiện những sự sai khác nhất định. Bên cạnh đó, mô hình tiến hóa thích hợp và cây phát sinh chủng loại cho mỗi chỉ thị cũng đƣợc xây dựng b ng phần mềm MEGAX, sử dụng phƣơng pháp Maximum likelihood và giá trị bootstrap 1000.
3.2.5.1 So sánh và phân tích trình tự các chỉ thị DNA a) Chỉ thị ITS1 a) Chỉ thị ITS1
Từ kết quả so sánh trình tự, quan sát đƣợc một số điểm khác biệt của trình tự ITS1 giữa mẫu thu thập cũng nhƣ giữa một số mẫu trong cùng chi Asarum L.. Trong đó, mẫu Tế tân Lai Châu có trình tự tƣơng đồng cao nhất
với loài JF975949.1 (A. splenden), sau đó là loài JF975922.1 (A. delavayi). Bên cạnh đó, mẫu Tế tân Lai Châu có một số vị trí khác biệt với hầu hết các loài so sánh (96 C⇒T, 137 A⇒G, 143 A⇒G, 184 C⇒T, 214 C⇒T). Hai mẫu Tế tân Bắc Phong Sinh và Tế tân Yên Tử có trình tự tƣơng đồng cao với nhau, tồn tại một điểm đặc trƣng riêng cho 2 mẫu này (thêm nucleotide T ở vị trí 111), và cũng khá tƣơng đồng với các loài còn lại, điều này có thể giải thích do sự gần gũi về mặt địa lý khi thu thập hai mẫu này. Ngƣợc lại, mẫu Tế tân thu thập từ Tam Đảo có sự khác biệt lớn hơn so với tất cả các trình tự đƣợc so sánh (vị trí 47, 208, 213, 216 và 240). Nhƣ vậy có khá nhiều đa hình trong vùng ITS1 của các loài thu thập ở Việt Nam (Xem hình 3.9).
10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.yentuense(BPS) .................................................. A.petelotii(TD) ..............................................T... A.yentuense(YT) .................................................. FJ428635.1 .................................................. FJ428634.1 .................................................. LC530386.1 .................................................. FJ428633.1 .................................................. FJ980374.1 .................................................. JF975922.1 .................................................. JF975949.1 .................................................. MH711018.1 ..........................C.T.................T... 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A.splendens(LC) CGGGGGCGGCGTTCAACCAACCCCGTCCCTTTGCGCTGCGGGATGCTCTT A.yentuense(BPS) ...........................................T...C A.petelotii(TD) ...........................................T.... A.yentuense(YT) ...........................................T...C FJ428635.1 ...........................................T...C FJ428634.1 ..................................C........T...C LC530386.1 ...........................................T...C FJ428633.1 ............................C..............T...C FJ980374.1 ................................................ JF975922.1 ................................................ JF975949.1 ................................................ MH711018.1 ........A.......................A.C...A....T.... 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.splendens(LC) GTCTCAAGCC-TTGAGCAATCAGGTTTGTTGACGGTGCATTCGGCGGCTG
A.yentuense(BPS) ..........T.........................A.....A.......
A.petelotii(TD) ..........-.........................A.....A.......
A.yentuense(YT) ..........T.........................A.....A.......
FJ428634.1 ..........-.........................A.....A....... LC530386.1 ..........-.........................A.....A....... FJ428633.1 ..........-.........................A.G...A....... FJ980374.1 ..........-....................................... JF975922.1 ..........-.........................R.....A....... JF975949.1 ..........-....................................... MH711018.1 ..........-..........GA.............A....TA....T.. 160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.splendens(LC) ACTTAGGGAGGCCGAACAACAACTCGGCGCGGTTAGCGCCAAGGATTTGG
A.yentuense(BPS) .................................C................ A.petelotii(TD) .................................C................ A.yentuense(YT) .................................C................ FJ428635.1 .................................C................ FJ428634.1 .................................C................ LC530386.1 .................................C................ FJ428633.1 .................................C................ FJ980374.1 .................................................. JF975922.1 .................................................. JF975949.1 .................................................. MH711018.1 CT................................................ 210 220 230 240 ....|....|....|....|....|....|....|....|
A.splendens(LC) AATTTACATGTG-TGCCATTCTCATTCGTGGG-TTTGTCG
A.yentuense(BPS) ..-.........-C..................-....... A.petelotii(TD) ..-....G....A..T................-......A A.yentuense(YT) ..-.........-C..................-....... FJ428635.1 ..-.........-C..................-....... FJ428634.1 ..-.........-C..................-....... LC530386.1 ..-....G....A..T................-......A FJ428633.1 ..-.........-C..................-.......
FJ980374.1 .........-...............G...-.......
JF975922.1 ..-.........-...................-.......
JF975949.1 .........-...................-.......
MH711018.1 ..-.A.T....A-..A................C......T
Hình 3.9: So sánh một số trình tự chỉ thị ITS1 của chi Asarum L.
Chú thích: FJ428635.1 (A. hongkongense), FJ428634.1 (A. longerhizomatosum), LC530386.1 (A. petelotii), FJ428633.1 (A. sagittarioides), FJ980374.1 (A. maximum), JF975922.1 (A. delavayi),
JF975949.1 (A. splendens), MH711018.1 (Saruma henryi)
b) Chỉ thị ITS2
Đối với chỉ thị ITS2 vùng đa hình của các mẫu xảy ra nhiều từ vị trí
205 đến 255. Kết quả so sánh các trình tự, có thể quan sát đƣợc sự tƣơng đồng ở hai mẫu Tế tân Bắc Phong Sinh và Tế tân Yên Tử mà ít hoặc không có sự tƣơng đồng với các trình tự khác từ cơ sở dữ liệu GenBank (vị trí 209, 220 và 328 T⇒G). Bên cạnh đó, mẫu Tế tân Tam Đảo có nhiều vị trí tƣơng đồng đặc hiệu với trình tự của loài LC530386.1 (A. petelotii) (208 A⇒T, 222 C⇒T, 228 C⇒T, 252, 253 thêm nucleotide AG và 255 C⇒T). Điều khác biệt ở đây là hầu hết sai khác đều là đột biến nucleotide C thành T. Cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong trình tự của mẫu Tế tân Tam Đảo của Việt Nam. Mẫu Tế tân Lai Châu có trình tự tƣơng đồng cao nhất với trình tự JF975949.1 (A. splendens) và JF975922.1(A. delavayi) trong số các trình tự đƣợc so sánh (Xem hình 3.10).
10 20 30 40 50 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.splendens(LC) ATGCGATACTTGGTGTGAATTGCAGAATCCCGTGAACCATCGAGTCTTTG
A.yentuense(BPS) .................................................. A.yentuense(YT) .................................................. A.petelotii(TD) .................................................. FJ428635.1 .................................................. FJ428634.1 .................................................. LC530386.1 .................................................. FJ428633.1 .................................................. FJ980374.1 ..................................................
JF975922.1 .................................................. JF975949.1 .................................................. MH711018.1 .................................................. 60 70 80 90 100 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A.splendens(LC) AACGCAAGTTGCGCCCGAGACCTTTAGGTTGAGGGCACACCTGCTTGGGC A.yentuense(BPS) .................................................. A.yentuense(YT) .................................................. A.petelotii(TD) .................................................. FJ428635.1 .................................................. FJ428634.1 .................................................. LC530386.1 .................................................. FJ428633.1 .................................................. FJ980374.1 .................................................. JF975922.1 .................................................. JF975949.1 .................................................. MH711018.1 .................................................. 110 120 130 140 150 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.splendens(LC) GTCATGCTATGCGTCGCTCCCACATCCATCTC---GGATATAGG
A.yentuense(BPS) ................................---....... A.yentuense(YT) ................................---....... A.petelotii(TD) ................................---....... FJ428635.1 ................................---....... FJ428634.1 ................................---....... LC530386.1 ................................---....... FJ428633.1 ................................---.....C... FJ980374.1 ................................---....... JF975922.1 ................................---....... JF975949.1 ................................---....... MH711018.1 .........C......................AATAGAAGT.......
160 170 180 190 200 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.splendens(LC) ACGCGGAGATTGGCTATCCGTTCAAATCCTTGCGCGGTTTGCCTAAAATT
A.yentuense(BPS) .............................................. A.yentuense(YT) .............................................. A.petelotii(TD) .............................................. FJ428635.1 ................................A............. FJ428634.1 .............................................. LC530386.1 .............................................. FJ428633.1 .............................................. FJ980374.1 .............................................. JF975922.1 .............................................. JF975949.1 .............................................. MH711018.1 .T.........................AT...T......G...... 210 220 230 240 250 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| A.splendens(LC) TGGACCTACGGTGGACTGCGACACGTCCAGTGGTGGTTGTTGGCTTATCA A.yentuense(BPS) ........Y..........A.............................. A.yentuense(YT) ........Y..Y.......A.............................. A.petelotii(TD) .......TT............T.....T...................... FJ428635.1 ........T..........T.............................. FJ428634.1 ...................A.............................. LC530386.1 .......TT............T.....T...................... FJ428633.1 ........T.......................................A. FJ980374.1 .................................................. JF975922.1 ........T....................................W.... JF975949.1 .................................................. MH711018.1 ...C...TT........A...T..A..T..................TATT 260 270 280 290 300 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
A.yentuense(BPS) --................................................ A.yentuense(YT) --................................................ A.petelotii(TD) AG..T.............................................