b ng công cụ tin sinh
3.2.5.2 Xây dựng cây phân loại dựa trên các chỉ thị DNA
Kết quả xây dựng cây phân loại từ các chỉ thị vùng nhân của các mẫu Tế tân ITS1 một lần nữa khẳng định các kết quả phân tích trình tự cho thấy quan hệ gần gũi của hai mẫu Tế tân Bắc Phong Sinh và Tế tân Yên Tử, cũng nhƣ với các loài A. hongkongense, A. sagittarioides, A.longerhizomatosum. Sự phân nhánh tách biệt của mẫu Tế tân Tam Đảo
và A. petelotii dựa trên chỉ thị ITS1. Mẫu Tế tân Lai Châu có quan hệ gần gũi với loài A. splendens, A. maximum và A. delavayi với chỉ số bootstrap
đáng tin cậy. Kết quả dựng cây phân loại trên chỉ thị ITS2 cũng cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa các loài tƣơng tự cây ITS1, qua đó cho thấy sự phân biệt khá tốt giữa các loài khi kết hợp các chỉ thị nhân gồm ITS1 và ITS2 (Xem hình 3.13 và Hình 3.14).
Hình 3.13: Cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS1
Chú thích: FJ428635.1 (A. hongkongense), FJ428634.1 (A. longerhizomatosum), LC530386.1 (A. petelotii), FJ428633.1 (A. sagittarioides), FJ980374.1 (A. maximum), JF975922.1 (A. delavayi)
JF975949.1 (A. splendens), MH711018.1 (Saruma henryi)
Hình 3.14: Cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS2
Chú thích: FJ428635.1 (A. hongkongense), FJ428634.1 (A. longerhizomatosum), LC530386.1 (A. petelotii), FJ428633.1 (A. sagittarioides), FJ980374.1 (A. maximum), JF975922.1 (A. delavayi)
Trong hai chỉ thị lục lạp, thì chỉ thị matK cũng cho thấy sự phân biệt
các mẫu cùng loài khá rõ. Tuy nhiên, quan hệ của các loài trong chi Asarum L. vẫn chƣa đƣợc phân tách rõ, khi hai mẫu Tế tân Bắc Phong Sinh và Tế tân Yên Tử n m trong cùng một nhánh nhỏ (cùng với A. longerhizomatosum),
mẫu Tế tân Tam Đảo cùng nhánh với loài A. Petelotii, A. sagittarioides và A.
hongkongense). Cũng tƣơng tự với chỉ thị vùng nhân, quan hệ gần gũi của
mẫu Tế tân Lai Châu và trình tự A. splendens từ GenBank (hay A. chingchengense), với giá trị bootstrap cao nhất trên cây phân loại. Để có đƣợc
tính chính xác và phân tách rõ hơn thì có thể cần có số lƣợng mẫu nghiên cứu lớn hơn. Tuy nhiên, chỉ thị rpoC có tính bảo thủ rất cao trong trình tự nên việc dựng cây phân loại cũng không phân biệt đƣợc các loài khác nhau (Xem hình 3.15 và hình 3.16).
Hình 3.15: Cây phân loại dựa trên chỉ thị matK
Chú thích: FJ428687.1 (A. hongkongense), FJ428693.1 (A. longerhizomatosum), LC530482.1 (A. petelotii), FJ428690.1 (A. sagittarioides), LC530438.1 (A. maximum), MG554427.1 (A. delavayi),
Hình 3.16: Cây phân loại dựa trên chỉ thị rpoC
Chú thích: GQ436064.1 (A. maximum), MG554429.1 (A. delavayi),
MK577409.1 (A. heterotropoides), MG554458.1 (A. megacalyx), MG554436.1 (A. sieboldii), MG554425.1 (A. minus), LC529900.1 (A.
forbesii), NC_039933.1 (Saruma henryi)
Nhìn chung, cây phân loại dựa trên chỉ thị ITS1, ITS2 và matK đã
phân biệt rất tốt các loài Tế tân Yên tử, Tế tân Thanh Thành và Tế tân pételot với các loài khác. Vì tính thuận tiện khi ứng dụng do có kích thƣớc ngắn và dễ dàng khuếch đại lên với PCR nên các vùng ITS đƣợc sử dụng
rộng rãi trong phân tích hệ thống tiến hóa và phân loại ở cả nấm, thực vật một lá mầm hay hai lá mầm [42], [43], [44]. Kết quả này cho thấy chúng tôi đã sử dụng hai chỉ thị ITS1 và ITS2 khá phù hợp trong việc đánh giá
chung vì 2 chỉ thị này đƣợc cho là rất hiệu quả trong việc đánh giá mối quan hệ phát sinh giữa các loài trong các nghiên cứu về mã vạch phân tử ở thực vật chẳng hạn nhƣ các loài tầm bóp (Physalis) họ Cà (Solanacea) [45]. Tƣơng tự nhƣ vậy nhiều nghiên cứu khác đã sử dụng chỉ thị ITS trong phân tích nhƣ để phân tích họ Ehreatiaceae chia làm 4 lớp nhỏ và chỉ rõ loài Xạ đen (E. asperula) thuộc vào nhóm Ehretia I, cũng nhƣ sử dụng chỉ thị ITS1 có thể phân biệt đƣợc loài này với loài khác trong cùng Chi [46]. Hay chỉ
thị ITS cũng đã dùng để phân biệt rất rõ loài Sâm Ngọc Linh với Sâm Vũ Diệp và sâm khác [47]. Hơn thế, toàn bộ vùng ITS và vùng 5,8S còn có thể dùng phân loại cũng nhƣ xây dựng cây tiến hóa và phát sinh loài khi số lƣợng mẫu đủ lớn khoảng trên 100 mẫu, chỉ thị matK cũng đƣợc sử dụng
hết sức hiệu quả trong nghiên cứu này [48].
Trong nghiên cứu đối với việc xác thực các loại thảo dƣợc, khá nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng vùng chỉ thị ITS2 làm barcode và kết hợp với chỉ thị psbA-trnH [49], [50]. Đặc biệt với việc xác định các mẫu cây thuốc nguyên liệu đã sơ chế ở thị trƣờng thảo dƣợc, việc nhầm lẫn tên do nguyên nhân khách quan hoặc chủ quan có thể xảy ra. Wu và công sự 2015 đã thu thập 28 mẫu Tế tân thô ở thị trƣờng thảo dƣợc và sử dụng chỉ thị ITS2 kết
hợp với chỉ thị psbA-trnH để giám định thì chỉ có 20 mẫu cho kết quả đúng là thuộc thảo dƣợc Tế tân. Còn một số mẫu đã bị nhầm sang thảo dƣợc thuộc loài khác nhƣ Stephania tetrandra và Aristolochia fangchi hay Aristolochia
tuberosa [50]. Nhƣ vậy cho thấy tầm quan trọng của việc định loại thảo dƣợc rất cần thiết cũng nhƣ cho thấy sự chính xác khi sử dụng barcode đối với loại Tế tân.
Đến nay các chỉ thị DNA vẫn đƣợc sử dụng rất hiệu quả trong việc xác định các loài thảo dƣợc, ví dụ nhóm lan (orchids) gần đây cũng đƣợc
đánh giá với 5 chỉ thị ITS, ITS2, matK, rbcL, trnH-psbA trong nghiên cứu
của Raskoti và cộng sự 2021. Nghiên cứu đã sử dụng 431 trình tự phân
tích và tích hợp cùng với trên 6000 trình tự từ cơ sở dữ liệu, cho thấy ITS
vẫn hiệu quả nhất, hoặc sự kết hợp giữa ITS và matK cũng cho độ chính
xác càng cao [50]. Sự kết hợp chỉ thị DNA ở bèo tấm là rất quan trọng vì trong khi nhóm thực vật này có rất nhiều loài khác nhau nhƣng đặc điểm
hình thái nhận dạng rất khó vì rất nhỏ và giống nhau. Nghiên cứu năm
2021 của Al-Dakhil và cộng sự đã nhận dạng các loại bèo tấm phổ biến ở
Ara Saudi gồm L. punctata, L. perpusilla, S. polyryiza, L. gibba, L. minor,
L. punctate Saudi và đƣợc xác định với 6 chỉ thị lục lạp là trnH-
psbA, matK, and atpF-atpH. [51]
Nhƣ vậy, mặc dù các chỉ thị DN barcoding đã đƣợc sử dụng khá lâu trong nghiên cứu định loại, nghiên cứu hệ thống học thực vật nhƣng đến nay các nghiên cứu vẫn tiếp tục đƣợc tiến hành trên rất nhiều nhóm,
loài thực vật khác nhau cho thấy phƣơng pháp này vẫn duy trì tính hữu dụng và chính xác. Việc nghiên cứu cây Tế tân b ng phƣơng pháp chỉ thị DNA barcoding là hợp lý và tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo về nghiên cứu phân tử của loài này khi hiện tại chƣa có nhiều công bố theo hƣớng này cho cây Tế tân ở nƣớc ta cũng nhƣ ứng dụng cho những hệ gen dƣợc liệu quý khác của Việt Nam.
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
1. Thu thập đƣợc 4 mẫu Tế tân gồm 1 mẫu A. splendens, 2 mẫu A. yentuense và 1 mẫu A. petelotii; đã tách chiết và tinh sạch DN làm
khuôn cho việc PCR khuếch đại các chỉ thị DNA barcoding.
2. Khuếch đại đƣợc 4 chỉ thị DN gồm ITS1, ITS2, matK và rpoC, có độ đặc hiệu cao, giải mã trình tự theo phƣơng pháp Sanger, đã phân tích và so sánh các chỉ thị DN barcoding của các mẫu với các trình tự trên ngân hàng gen NCBI.
3. Phân tích sự đa dạng trong trình tự các đoạn chỉ thị ITS1, ITS2, MatK
và rpoC trên các mẫu nghiên cứu cho thấy sự bảo thủ cao của chỉ thị
rpoC và có nhiều điểm đa hình của các chỉ thị ITS1, ITS2 và matK đặc
trƣng cho loài Tế tân Thanh Thành.
4. Cung cấp cho cơ sở dữ liệu trình tự gen lần đầu tiên chỉ thị vùng rpoC của Tế tân pételot và 4 chỉ thị ITS1, ITS2, matK và rpoC ở loài Tế tân
Yên Tử.
KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Asarum L, this genus is accepted, and its native range is Temp,
Northern Hemisphere. Plants of the World Online, https://powo.science.kew.org/taxon/urn:lsid:ipni.org:names:3127-1
2. Phạm Hoàng Hộ, 1999, Cây cỏ Việt Nam,
tập 1, Nxb Trẻ, TP Hồ Chí Minh.
3. Đỗ Tất Lợi, 2004, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, tr. 566.
4. Sách Đỏ Việt Nam, 2007, Phần II - Thực vật, Nxb Khoa học tự nhiên và Công nghệ, tr. 94 - 98.
5. Võ Văn Chi, 2012, Từ điển Cây thuốc Việt Nam, Tập 1 và Tập 2, Nxb Y học Hà Nội.
6. Nguyen Anh Tuan, Tran Huy Thai, Jenn-Che Wang, Chang-Tse Lu, 2012, Bổ sung loài A. cordifolium C. E. C. Fischer (họ Mộc hƣơng - Aristolochiaceae) cho hệ thực vật Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 34(2) tr. 197-200.
7. Nguyễn Anh Tuấn, Trần Huy Thái, Jenn-Che Wang, Chang-Tse Lu, 2012, Bổ sung loài A. yunnanense T. Sugaw., Ogisu & C.Y. Cheng (họ Mộc hƣơng - Aristolochiaceae) cho hệ thực vật Việt Nam, Tạp chí Sinh
học, 34(4) tr. 441-445.
8. Nguyen Anh Tuan, Bui Hong Quang, Nguyen Quang Hung and Akihiko Sasamoto, 2018, A. yentuense sp. nov. (Aristolochiaceae) from Vietnam, Nordic jounal of Botany, e01586
9. Tổng cục Lâm nghiệp, 2010, “Điều tra đánh giá tình trạng bảo tồn các
loài thực vật rừng nguy cấp, quý hiếm thuộc danh mục nghị định 32/2006/NĐ-CP theo vùng sinh thái”, Trung tâm Tài nguyên và Môi
trƣờng Lâm nghiệp Viện Điều tra Quy hoạch Rừng.
10. Acta Phytotax. Sin. 13(2), 22, 1975,
http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/kew-2654461
12. Đỗ Văn Tuân, Đặng Văn Thạch, Lê Đình Trƣờng, 2011, Nghiên cứu về nguồn tài nguyên cây thuốc có chứa tinh dầu tại vƣờn quốc gia Tam Đảo và vùng đệm, Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 4, tr. 1344.
13. Jing Y., Y.-F. Zhang, M-Y Shang, G.-X. Liu, Y-L. Li, X. Wang, S.-Q. Cai, 2017, Chemical Constituents from the Roots and Rhizomes of
Asarum heterotropoides var. mandshuricum and the In Vitro Anti-
Inflammatory Activity, Molecules, 22(1), pp.125.
14. Zhang, S., S. Cai, and Y. Zhao, 2001, Studies on the chemical constituents of Asarum longerhizomatosum CF Liang et CS Yang, China journal of Chinese materia medica, 26(11), pp. 762-763.
15. Zhang, F., Q. Xu, S. Fu, X. Ma, H. Xiao, and X. Liang, 2005, Chemical constituents of the essential oil of Asarum forbesii Maxim (Aristolochiaceae), Flavour fragrance journal, 20(3), pp. 318-320. 16. Cai, S.-Q., J. Yu, X. Wang, R.-Q. Wang, F.-X. Ran, M.-Y. Shang, J.-R.
Cui, K. Komatsu, and T. Namba, 2008, Cytotoxic activity of some Asarum plants, Fitoterapia, 79(4), pp. 293-297.
17. Ji, W., J. Hu, X. Yu, L. Zhang, M. Liu, and Q. Wang, 2017, Study on the inhibitory effects of ephedra aconite asarum decoction on LPS- induced dendritic cells, Evidence-Based Complementary Alternative Medicine, 2017, pp. 1-12.
doi: 10.1155/2017/3272649, Epub 2017 Nov 26, PMID: 29333181; PMCID: PMC5733235.
18. Michl, J., O. Bello, G.C. Kite, M.S. Simmonds, and M. Heinrich, 2017, Medicinally used Asarum species: high-resolution LC-MS analysis of aristolochic acid analogs and in vitro toxicity screening in HK-2 cells,
Frontiers in pharmacology, 8, pp. 215.
doi:10.3389/fphar. 2017.00215
19. Li, Y., L. Han, C. Huang, W. Dai, G. Tian, F. Huang, J. Li, J. Liu, Q. Wang, and Z. Zhou, 2018, New contributions to Asarum powder on
immunology related toxicity effects in lung, Evidence-Based Complementary Alternative Medicine, 2018, pp. 17-25.
https://doi.org/10.1155/2018/1054032.
20. Chen, C., X. Shi, T. Zhou, W. Li, S. Li, and G. Bai, 2021, Full-length transcriptome analysis and identification of genes involved in asarinin and aristolochic acid biosynthesis in medicinal plant Asarum sieboldii, Genome, 64(6), pp. 639-653.
doi: 10.1139/gen-2020-0095. Epub ahead of print. PMID: 33320770. 21. Antsyshkina, A., D. Bokov, N. Pozdnyakova, T. Prostodusheva, and S.
Zaichikova, 2020, The Genus Asarum L.: A Phytochemical and Ethnopharmacological Review, Systematic Reviews in Pharmacy,
11(5), pp. 472-502.
22. Jang, S., S.H. Park, and H.K. Kim, 2020, Simultaneous Determination of 6 Antiallergic Components in Asarum sieboldii Using High-
Performance Liquid Chromatography, Natural Product Communications, 15(10), pp. 1934578-20966191.
doi:10.1177/1934578X20966191
23. Trần Văn Kỳ, 2016, 250 Bài Thuốc Đông Y Cổ Truyền Chọn Lọc, Nxb Đà Nẵng.
24. Lê Thị Thanh Hƣơng, Nguyễn Thị Thuận, Nguyễn Nghĩa Thìn, 2011, Những cây thuốc đƣợc sử dụng thay thế mật gấu theo kinh nghiệm dân gian và đông y ở một số địa bàn tỉnh Thái Nguyên, Hội nghị khoa học
toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 4, tr.1172.
25. Hanze Liu, Changhong Wang, 2022, The genus Asarum: A review on phytochemistry, ethnopharmacology, toxicology and pharmacokinetics.
Journal of Ethnopharmacology, 2022, 282, 114642.
doi: 10.1016/j.jep.2021.114642
26. Han, Y., Kim, S.-J., 2003, Memory enhancing actions of Asiasari radix extracts via activation of insulin receptor and extracellular ignal regulated kinase (ERK) I/II in rat hippocampus. Brain Res. 974 (1–2), pp. 193–201. doi.org/10.1016/s0006-8993(03)02580-0
27. Park, H.J., Lee, K.S., Zhao, T.T., Lee, K.E., Lee, M.K., 2017, Effects of asarinin on dopamine biosynthesis and 6-hydroxydopamine- induced cytotoxicity in PC12 cells. Arch Pharm. Res. (Seoul) 40 (5), pp. 631–639.
doi.org/10.1007/s12272-017- 0908-z
28. Nguyễn Chiến Binh, 2017, Nghiên cứu đặc điểm thực vật và thành phần hoá học của một sô loài Asarum L. dùng làm thuốc ở Việt Nam,
Luận văn Thạc sĩ Dƣợc học, Đại học Dƣợc Hà Nội.
29. Trần Minh Hợi, 2004, Thành phần hoá học của tinh dầu Thổ tế tân (Asarum caudigerum Hance) ở Hƣơng Sơn (Hà Tĩnh), Tạp chí Sinh học, 26(4) tr. 59-60.
30. Trần Huy Thái, Nguyễn Thị Hiền, Đỗ Thị Minh, Nguyễn Anh Tuấn, 2010, Thành phần hóa học của tinh dầu hoa tiên (Asarum glabrum Merr.) ở Hà Giang, Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 32(1) tr. 94-96.
31. Group, C.P.W., P.M. Hollingsworth, L.L. Forrest, J.L. Spouge, M. Hajibabaei, S. Ratnasingham, M. van der Bank, M.W. Chase, R.S. Cowan, and D.L. Erickson, 2009, A DNA barcode for land plants, Proceedings of
the National Academy of Sciences, 106(31), pp. 12794-12797.
32. Kress, W.J., K.J. Wurdack, E.A. Zimmer, L.A. Weigt, and D.H. Janzen, 2005, Use of DNA barcodes to identify flowering plants, Proceedings of the National Academy of Sciences, 102(23), pp. 8369-8374.
33. Chase, M.W., R.S. Cowan, P.M. Hollingsworth, C. Van Den Berg, S. Madriñán, G. Petersen, O. Seberg, T. Jørgsensen, K.M. Cameron, and M. Carine, 2007, A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants, Taxon, 56(2), pp. 295-299.
34. Dong, W., J. Liu, J. Yu, L. Wang, and S. Zhou, 2012, Highly variable chloroplast markers for evaluating plant phylogeny at low taxonomic levels and for DNA barcoding, PloS one, 7(4), pp. e35071.
35. Serino, G. and P. Maliga, 1998, RNA polymerase subunits encoded by the plastid rpo genes are not shared with the nucleus-encoded plastid enzyme, Plant Physiology, 117(4), pp. 1165-1170.
36. Bellarosa, R., M.C. Simeone, A. Papini, and B. Schirone, 2005, Utility of ITS sequence data for phylogenetic reconstruction of Italian Quercus spp, Molecular phylogenetics evolution, 34(2), pp. 355-370.
37. Wu, L., W. Sun, B. Wang, H. Zhao, Y. Li, S. Cai, L. Xiang, Y. Zhu, H. Yao, and J. Song, 2015, An integrated system for identifying the hidden assassins in traditional medicines containing aristolochic acids,
Scientific reports, 5(1), pp. 1-10. doi:10.1038/srep11318
38. Sinn, B.T., L.M. Kelly, and J.V. Freudenstein, 2015, Phylogenetic relationships in Asarum: effect of data partitioning and a revised classification, American Journal of Botany, 102(5), pp. 765-779.
39. Sinn, B.T., D.D. Sedmak, L.M. Kelly, and J.V. Freudenstein, 2018, Total duplication of the small single copy region in the angiosperm plastome: rearrangement and inverted repeat instability in Asarum,
American Journal of Botany, 105(1), pp. 71-84.
40. Takahashi, D. and H. Setoguchi, 2018, Molecular phylogeny and taxonomic implications of Asarum (Aristolochiaceae) based on ITS and matK sequences, Plant Species Biology, 33(1), pp. 28-41.
41. Yao, G., W. Ma, X. Huang, Q. Jia, J. Shen, Y. Chang, H. Ouyang, and J. He, 2020, Identification and quality evaluation of raw and processed Asarum species using microscopy, DNA barcoding, and gas chromatography-mass spectrometry, Journal of analytical methods in chemistry, 2020, pp. 17-25. doi: 10.1155/2020/2690238. PMID:
32351753; PMCID: PMC7174948.
42. O. Seberg, G. Petersen, 2009, “How many loci does it take to DN barcode a crocus?”, PloS one, 4(2), pp. e4598. doi: 10.1371/journal.pone.0004598.
43. M.W. Chase, et al, 2005, “Land plants and DN barcodes: short-term and long-term goals”, Philosophical Transactions of the Royal Society,
Biological Sciences, 360(1462), pp. 1889-1895.
44. W.J. Kress, et al, 2005, “Use of DN barcodes to identify flowering plants”, in Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 102, pp. 8369-8374.
45. Feng S., Jiang M., Shi Y., Jiao K., Shen C., Lu J., Ying Q., Wang H.,, 2016, Application of the Ribosomal DNA ITS2 Region of Physalis (Solanaceae): DNA Barcoding and Phylogenetic Study. Front. Plant Sci. 7:1047. doi: 10.3389/fpls.2016.0104
46. Nguyen Thuy Linh, Pham Thi Hang, Do Van Truong, Huynh Thi Thu Hue, 2017,Evaluating the systematic position of Ehretia asperula Zoll. &