Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân tinh bột khoa

5. Những điểm mới của luận án

3.2.1. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân tinh bột khoa

bằng enzyme pullulanase hướng tới sự hình thành tinh bột tiêu hóa chậm

Enzyme pullulanase cắt nhánh mạch tinh bột tạo sự hình thành các chuỗi phân tử mạch thẳng với mức độ trùng hợp thấp, tạo điều kiện dễ dàng hình thành cấu trúc xoắn kép ổn định và gia tăng mức độ trật tự tổng thể của các phân tử tinh bột. Chính sự thay đổi cấu trúc này đã dẫn đến khả năng tiêu hóa của tinh bột được điều chỉnh.

(1) Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột tới sự hình thành tinh bột tiêu hóa chậm

Để đánh giá ảnh hưởng của nồng độ tinh bột tới khả năng tiêu hóa của hỗn hợp sau khi thủy phân bằng enzyme pululanase, các thí nghiệm được thực hiện trên dịch tinh bột chiết tách từ khoai lang HLC có nồng độ thay đổi trong khoảng từ 5 đến 15% với bước nhảy 2,5% (w/v), pH 5,0, nhiệt độ 55°C, nồng độ enzyme pullulanase 30 U/g và thời gian thủy phân 4 giờ. Từ kết quả nghiên cứu (Hình 3.4) lựa chọn được nồng độ tinh bột tối ưu cho hoạt động thủy phân của enzyme pullulanase trong sản xuất SDS.

Nồng độ cơ chất tinh bột ảnh hưởng trực tiếp tới mức độ thủy phân tạo SDS được thể hiện trên Hình 3.4. Hàm lượng SDS thu được tăng khi tăng nồng độ dịch tinh bột tăng từ 5-10%. Hàm lượng SDS lớn nhất đạt 27,68% khi tiến hành thí nghiệm trên dịch tinh bột nồng độ 10% (w/v), trong khi đó, ở nồng độ tinh bột thấp hơn là 5% và 7,5%, hàm lượng SDS thu được thấp hơn, đạt lần lượt 19,26% và 25,96%. Như vậy trong khoảng nồng độ này, khi nồng độ cơ chất tăng thì tốc độ hoạt động của enzyme cũng tăng tương ứng. Thêm vào đó, ở giai đoạn đầu của phản ứng thủy phân, vận tốc của phản ứng gần như tỷ lệ thuận với nồng độ cơ chất. Khi có nhiều nhiều phân tử cơ chất liên kết với các phân tử enzyme hơn dẫn đến sản phẩm tạo thành tăng lên. Kết quả này cũng tương đồng với kết quả đạt được từ nghiên cứu của Kuddus và cộng sự, năm 2019 [235]. Tương tự, theo kết quả nghiên cứu của Zeng và cộng sự, năm 2015 [112], quá trình thủy phân của enzyme pullulanase trên tinh bột gạo nếp cũng đem lại hiệu quả tốt nhất tại nồng độ tinh bột 10% và hàm lượng SDS thu được giá trị lớn nhất là 29,6%.

Hình 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột tới sự hình thành tinh bột tiêu hóa chậm

Mức độ thủy phân tạo SDS giảm nhẹ khi nồng độ dịch tinh bột được gia tăng hơn nữa, trên 10% (w/v). Cụ thể, tại nồng độ tinh bột 12,5% và 15% hàm lượng SDS tạo thành giảm, lần lượt đạt 24,52% và 23,88%. Kết quả này có thể được giải thích như sau: trong quá trình thủy phân bằng enzyme, nước đóng vai trò vừa là môi trường phản ứng và vừa là môi trường vận chuyển tạo điều kiện thuận lợi cho sự khuếch tán và di chuyển của các phân tử trong phản ứng, do đó cơ chất và enzyme được phân bố đồng đều để tiếp xúc tốt hơn. Bên cạnh đó, nước còn giúp tinh bột phân tán tốt và ngăn chặn nồng độ sản phẩm trong hỗn hợp tập trung cao cục bộ gây ức chế phản ứng thủy phân [236]. Su và cộng sự, năm 2010 [237] chỉ ra rằng khi nồng độ tinh bột cao, dẫn tới khả năng trương nở kém đi và do đó khả năng tiếp xúc của enzyme với cơ chất bị giảm đáng kể, điều này dẫn tới mạch tinh bột khó bị tác động bởi enzyme, sự hình thành SDS do vậy cũng đạt hiệu suất kém.

Như vậy, kết quả nghiên cứu đã cho thấy tại nồng độ dịch tinh bột 10% (w/v) cho hiệu quả sản xuất SDS từ tinh bột khoai lang là cao nhất.

(2) Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pullulanase tới sự hình thành tinh bột tiêu hóa chậm

Thí nghiệm nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng nồng độ enzyme tới khả năng tiêu hóa của tinh bột khoai lang khi thủy phân bởi pullanase được tiến hành trên dịch tinh bột nồng độ 10% (w/v), pH 5,0, nhiệt độ 55oC, với nồng độ enzyme pullulanase thay đổi từ 10 U/g đến 50 U/g. Quá trình thủy phân diễn ra trong 4 giờ và kết quả được thể hiện trên biểu đồ Hình 3.5.

Hình 3.5. Ảnh hưởng của nồng độ enzyme tới sự hình thành tinh bột tiêu hóa chậm

Dữ liệu cho thấy sự thay đổi hàm lượng tinh bột tiêu hóa nhanh, tinh bột tiêu hóa chậm và tinh bột bền của sản phẩm khi nồng độ enzyme pullulanase thay đổi. Khi nồng độ enzyme pullulanase tăng dần từ 10 U/g đến 50 U/g, thành phần SDS và RDS cũng thể hiện xu hướng tăng dần, và RS thể hiện xu hướng ngược lại. Cụ thể, hàm lượng SDS tăng từ 20,55% lên 28,75%, hàm lượng RDS tăng từ 29,89 đến 38,73% và RDS giảm từ 49,56% xuống 32,52%. Sự có mặt của ezyme pullulanase dẫn tới quá trình phân cắt mạch nhánh amylopectin của tinh bột khoai lang, tạo nhiều mạch giống amylose. Các mạch này được chuyển thành cấu trúc xoắn kép sau giai đoạn thoái hóa làm cấu trúc tinh bột vững chắc hơn, dẫn đến sự cản trở tác động của enzyme tiêu hóa. Tỉ lệ gia tăng SDS, RS phụ thuộc nhiều vào độ dài mạch xoắn kép và chế độ thoái hóa. Với DP mạch thấp, sản phẩm chủ yếu tạo thành vùng vô định hình (SDS), với DP dài hơn thì khả năng tạo sản phẩm kết tinh RS cao hơn [118]. Phân tích thống kê cho thấy, sự thay đổi hàm lượng SDS khi tăng nồng độ enzyme từ 20 U/g đến 50 U/g không có sự khác biệt có nghĩa, tức là cơ chất tinh bột khoai lang đã được bão hòa bởi enzyme ở nồng độ 20 U/g. Do đó, lượng pullulanase tối ưu được lựa chọn là 20 U/g. Trong một số báo cáo trước đây, Wu và cộng sự đã cho thấy lượng enzyme pullulanase tối ưu là 10 U/g [238], Zang và cộng sự báo cáo hàm lượng pullulanase thích hợp trong sản xuất SDS là 12 U/g [239]. Bên cạnh đó, nồng độ enzyme cao hơn được sử dụng trong nghiên cứu Miao và công sự, hàm lượng SDS cao nhất có thể đạt được khi thủy phân bằng enzyme pullulanase ở nồng độ 20 hoặc 40 U/g trong thời gian 3 đến 6 giờ [121]. Cơ chất của phản ứng có thể là nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt này.

Như vậy, nồng độ enzyme pullulanase được sử dụng trong quá trình thủy phân tinh bột khoai lang hướng tới tạo SDS là 20 U/g.

(3) Ảnh hưởng của pH thủy phân tới sự hình thành tinh bột tiêu hóa chậm

theo chất khô), tại nhiệt độ 55oC, pH phản ứng thay đổi từ 4,0 đến 6,0 và duy trì phản ứng trong 4 giờ. Kết quả được thể hiện trong đồ thị Hình 3.6.

Hình 3.6. Ảnh hưởng của pH tới sự hình thành tinh bột tiêu hóa chậm

Nhận thấy, pH phản ứng có ảnh hưởng đáng kể tới hoạt tính của enzyme trong quá trình tạo các chuỗi mạch thẳng và sau đó là thoái hóa hình thành tinh bột tiêu hóa chậm và tinh bột bền. Cụ thể, hàm lượng SDS thu được tăng dần từ 20,98% đến 27,73% khi thay đổi pH phản ứng từ pH 4,0 đến pH = 5,0. Khi tiếp tục tăng pH lên đến pH = 6,0 thì hàm lượng SDS thu được là thấp nhất 19,38%. Phân tích thống kê cho thấy hàm lượng SDS tại pH 5,0 có giá trị lớn nhất và khác biệt với các điểm pH còn lại. Theo kết quả từ một số nghiên cứu trước đây, pH tối ưu được sử dụng trong quá trình thủy phân bởi enzyme pullulanase được nằm trong khoảng từ pH 5,2 đến pH 5,5 [169], [240], [241]. Kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với thông tin pH tối ưu của enzyme được cung cấp bởi nhà sản xuất (pHopt= 4,5 – 5,5).

Độ pH của môi trường ảnh hưởng protein enzyme và trạng thái phân ly cơ chất, dó đó quyết định sự ổn định của enzyme, khả năng kết hợp giữa enzyme với cơ chất, sự chuyển đổi cơ chất thành sản phẩm, và ảnh hưởng tới hiệu suất xúc tác bởi enzyme [236]. Sự khác biệt về pH tối ưu được sử dụng trong các nghiên cứu có thể được giải thích do sự khác biệt về cơ chất, nguồn gốc và độ tinh khiết của enzyme pullulanase.

Như vậy, lựa chọn pH 5,0 cho quá trình thủy phân tinh bột khoai lang bằng enzyme pullulanase hướng tới sự hình thành SDS.

(4) Ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự hình thành tinh bột tiêu hóa chậm

Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân bởi pullulanase tới khả năng tiêu hóa của tinh bột khoai lang được tiến hành với dịch tinh bột nồng độ 10% (w/v), môi trường pH 5,0, bổ sung nồng độ enzyme 20 U/g (tính theo chất

khô) trong thời gian phản ứng 4 giờ. Nhiệt độ duy trì phản ứng thay đổi từ 45 đến 65oC. Kết quả được trình bày trong Hình 3.7.

Hình 3.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân bởi pullulanase tới sự hình thành tinh bột tiêu hóa chậm

Nhiệt độ có vai trò quan trong trong quá trình xúc tác phản ứng enzyme. Nhận thấy, trong khoảng nhiệt độ từ 45 oC đến 55 oC, khả năng thủy phân của enzyme pullulanase có xu hướng tăng, được thể hiện thông qua hàm lượng SDS tăng từ 19,66% lên 27,98%. Tiếp tục nâng nhiệt độ quá trình thủy phân từ 55 oC lên 60 oC và 65 oC, khả năng thủy phân của enzyme pullulanase lại có xu hướng giảm, hàm lượng SDS giảm từ 27,98% xuống 22,00%. Phân tích thống kê cho thấy hàm lượng SDS thu được là cao nhất khi tinh bột được thủy phân tại 55 oC và có sự khác biệt có nghĩa với các trường hợp nhiệt độ còn lại. Kết quả này phù hợp với nhiệt độ tối ưu của chế phẩm topt= 55-60°C (được công bố bởi Megazyme). Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động thủy phân cũng có sự khác nhau phụ thuộc vào cơ chất hoạt động và nguồn gốc thu nhận enzyme. Trong một số nghiên cứu được báo cáo trước đây, quá trình cắt nhánh dưới tác dụng của enzyme pullulanase cùng nguồn gốc cũng được tiến hành ở nhiệt độ tương tự, Zhang và cộng sự (2019) [241] tiến hành phản ứng ở 50oC, trong khi nhóm nghiên cứu của Miao (2009) [121] duy trì dịch thủy phân tại 58 oC.

Hàm lượng SDS thấp nhất ở nhiệt độ 45oC cho thấy đường cong xu hướng của nhiệt độ: hàm lượng SDS tăng dần khi nhiệt độ tăng dần từ 45-55oC sau đó lại giảm dần cho đến khi nhiệt độ là 65oC. Như vậy, nhiệt độ 55oC được lựa chọn cho quá trình thủy phân tinh bột khoai lang bằng enzyme pullulanase.

pullulanase tới khả năng tiêu hóa của tinh bột khoai lang được tiến hành trên dịch tinh bột nồng độ 10% (w/v) trong môi trường pH 5,0, bổ sung enzyme pullulanase nồng độ 20 U/g, cố định nhiệt độ tại 55oC và tiến hành quá trình thủy phân. Trong thời gian từ 1 đến 8 giờ, mẫu thủy phân được lấy sau mỗi giờ và tiến hành thoái hóa để thu hỗn hợp sản phẩm. Phân tích khả năng tiêu hóa của sản phẩm cuối thu được kết quả Hình 3.8.

Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân pullulanase tới sự hình thành tinh bột tiêu hóa chậm

Nhận thấy, trong 7 giờ đầu của quá trình thủy phân, hàm lượng SDS và RDS trong sản phẩm thu được có xu hướng tăng dần và giảm nhẹ khi quá trình thủy phân tiếp tục. Cụ thể, khi thời gian thủy phân tăng từ 1 giờ đến 7 giờ, hàm lượng SDS và RDS thu được tăng dần tương ứng từ 19,09% lên 29,70% và từ 27,33 lên 41,06%. Khi thời gian kéo dài đến 8 giờ, thành phần SDS và RDS lần lượt giảm xuống 25,75% và 40,35%. Kết quả trên đã chỉ ra khi thời gian thủy phân tăng lên, phản ứng giữa enzyme và cơ chất liên tục xảy ra dẫn tới sự hình thành lượng lớn các phân tử mạch thẳng, làm tăng nguyên liệu cho quá trình thoái hóa tạo SDS ở giai đoạn tiếp theo. Phân tích thống kê cho thấy hàm lượng SDS đạt giá trị lớn nhất tại 6 giờ nhưng không có sự khác biệt có nghĩa với giá trị hàm lượng SDS tại 5 giờ và 7 giờ. Hàm lượng SDS giảm xuống khi quá trình thủy phân đạt 8 giờ có thể được giải thích do sự tạo thành các phân tử đường mạch ngắn hòa tan, gây ra bởi tính không đặc hiệu hoàn toàn của pullulanase, chúng có thể phân cắt cả các liên kết α-1,4 glycoside [242]. Bên cạnh đó, kết quả của cả quá trình thủy phân thu được là hàm lượng RS giảm mạnh từ 53,58% xuống 33,90%.

Xu hướng tương tự được quan sát bởi Miao và cộng sự (2009) [121]. Khi thời gian thủy phân tinh bột ngô nếp bằng enzyme pullulanase thay đổi từ 1 đến 24 giờ, hàm lượng SDS đạt được giá trị cao nhất nằm trong khoảng 3 đến 6 giờ và giảm dần khi thời gian thủy phân tăng lên tới 24 giờ. Guraya cùng cộng sự cũng cho thấy thời

gian thủy phân tinh bột tối ưu sản xuất SDS là 4 giờ [110]. Như vậy, thời gian thủy phân tinh bột khoai lang bằng pullulanse là 5 giờ được lựa chọn trong nghiên cứu này để tiết kiệm chi phí năng lượng.

Tóm lại, các thông số tối thích được lựa chọn cho quá trình thủy phân tinh bột khoai lang dưới tác dụng của enzyme pullulanase bao gồm: nồng độ dịch tinh bột 10% (w/v), pH 5,0, nhiệt độ thủy phân 55°C, nồng độ enzyme 20 U/g và thời gian thủy phân kéo dài trong 5 giờ. Hàm lượng SDS thu được đạt 28,59 ± 0,72%. Hỗn hợp sau khi thủy phân được sử dụng làm nguyên liệu cho các nghiên cứu tiếp theo trong quy trình tổng hợp SDS từ tinh bột khoai lang.

Nhận thấy, hàm lượng SDS thu được chưa cao. Bên cạnh đó, việc

áp dụng quá trình thoái hóa hướng đến việc hình thành cấu trúc tinh thể của hỗn hợp sau thủy phân đã được chứng minh làm tăng đáng kể hàm lượng SDS [121] [120]. Vì vậy, đê tài tiếp tục tiến hành công đoạn thoái hóa tinh bột với mục đích làm giàu lượng SDS thu được từ tinh bột khoai lang.

3.2.2. Nghiên cứu chế độ thoái hóa tinh bột sau thủy phân pullulanase làm tăng hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm

Nghiên cứu công đoạn thoái hóa lần 1:

(1) Ảnh hưởng của nhiệt độ thoái hóa lần 1 đến khả năng hình thành tinh bột tiêu hóa chậm

Thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thoái hóa lần 1 tới hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm được tiến hành ở các nhiệt độ -20℃, -10℃, 4℃ và 25℃ trong thời gian 48 giờ. Kết quả thu được được trình bày trong Bảng 3.8.

Dữ liệu trên cho thấy hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm đạt cao nhất là 44,50% với mẫu tinh bột được thoái hóa ở 4oC và hàm lượng thu được ở ba điêu kiện thoái hóa còn lại không cho thấy sự khác biệt có nghĩa. Việc hạ

nhiệt độ của gel tinh bột sau khi hồ hóa và thủy phân enzyme dẫn tới quá trình kết tinh lại (thoái hóa), các cấu trúc bị phá hủy sau thủy phân được sắp xếp lại tạo thành các tinh thể không hoàn thiện, từ đó dẫn tới sự tiêu hóa chậm tinh bột [24]. Theo Morris, sự hình thành tinh thể trải qua 3 bước: (1) Tạo mầm: hình thành các mầm tinh thể; (2) Phát triển: phát triển các tinh thể từ các mầm được hình thành; (3) Trưởng thành: hoàn thiện của tinh thể hoặc sự phát triển chậm của tinh thể [243].

Bảng 3.8. Ảnh hưởng của nhiệt độ thoái hóa lần 1 tới hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm (thời gian thoái hóa 48 giờ)

Nhiệt độ thoái hóa lần 1 (℃) Hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm (%)

Không thoái hóa 28,59 ± 0,72

-20℃ 36,85 ± 1,54a

Quá trình tạo hạt nhân tinh thể xảy ra ở nhiệt độ lạnh thường (4℃), khi đó

tinh thể tạo thành chưa hoàn chỉnh nên sự tấn công của enzyme vẫn có thể diễn

ra nhưng

ở tốc độ chậm, điêu này lý giải cho hàm lượng tinh bột tiêu hóa chậm cao. Quá trình hình thành tinh thể trưởng thành xảy ra khi thoái hóa tinh bột diễn ra ở

nhiệt độ phòng (25oC), một tinh thể hoàn chỉnh rất khó có thể bị phân giải nên hàm lượng tinh bột kháng tiêu hóa (RS) là cao hơn cả [243]. Nghiên cứu