8.1. Phương trình động học Michaelis – Menten.
Năm 1913, Michaelis và Menten đã đưa ra mô hình động học giải thích phản ứng được xúc tác bởi Enzyme và lập phương trình phản ánh quan hệ giữa vận tốc phản ứng và nồng độ cơ chất S và Enzyme. Điểm quan trọng nhất của mô hình này là trước khi phản ứng xúc tác xảy ra giữa E và S có sự tạo phức ES. Phức này tiếp tục biến đổi tạo ra sản phẩm phản ứng và giải phóng Enzyme để tiếp tục chu trình phản ứng xúc tác mới. E + S E S P + S k3 k1 k2 ( 3 . 6 ) Hình 3.14. Cơ chế xúc tác acid –base.
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 93
K1, K2, K3 là hằng số tốc độ của các vận tốc phản ứng tương ứng V1, V2,V3. ở đây K4 là hằng số tốc độ trong phản ứng tạo phức ES từ P và E là rất không đáng kể nên có thể bỏ qua. Do đó vận tốc chuyển hoá phức ES thành P và E là:
V0 = K3 [ES] (3.7)
sẽ quyết định mức độ phản ứng chuyển hoá S → P. Trong thực tế, vận tốc này phụ thuộc vào nồng độ ES. Nồng độ ES càng cao thì vận tốc phản ứng càng lớn. Giả sử ký hiệu:
[E0] = nồng độ Enzyme ban đầu [ES] = nồng độ Enzyme- cơ chất
[E] = nồng độ Enzyme tự do khi đạt điểm cân bằng. Ta có: [E] = [E0] – [ES]
Coi [S] là nồng độ cơ chất ban đầu và cũng được xem là nồng độ cơ chất ở trong trạng thái cân bằng của phản ứng. Vì trong thực tế, nồng độ cơ chất luôn luôn gấp nhiều lần Enzyme. Hơn nữa, trong nghiên cứu động học người ta thường chỉ quan tâm xác định tốc độ phản ứng ban đầu, khi lượng cơ chất bị chuyển hoá chưa đáng kể so với nồng độ ban đầu.
Từ (3.6) ta có:
a/ - Vận tốc phản ứng tạo phức ES là: K1 ([E0] – [ES]) [S] b/ - Vận tốc phân ly phức ES là tổng của 2 phản ứng.
ES phân ly thành E và S với hằng số tốc độ K2 và ES phân ly thành E và P với hằng số tốc độ K3. Do đó vận tốc phân ly phức ES là (K2 + K3) [ES]. Khi hệ thống đạt cân bằng ta có:
K1([E0] – [ES]) [S] = (K2 +K3) [ES] (3.8) Từ đó ta có: [ES] = K1 [E0] [S]/ K1 [S] + (K 2+ K 3)
Chia hai vế phải cho K1 và để dễ tính toán ta thay K2+K 3 / K1 bằng hằng số Michaelis –Menten Km, ta có:
[ES] = [E0 ] [S] /Km + [S] (3.9) Thay [ES] vào (3.7) ta có:
V0 = K 3[E0] [S] /Km + [S] (3.10)
Khi nồng độ cơ chất đủ lớn để tất cả các phân tử Enzyme tham gia phản ứng đều tạo phức với S, lúc ấy ta có:
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 94
Hình 3.15. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất đối với tốc độ xúc tác ban đầu.
Từ đó ta có: Vo = Vmax [S] /Km +[S] (3.11).
Phương trình (3.11) được gọi là phương trình Michaelis – Menten phản ứng tương quan định hướng giữa tốc độ ban đầu của phả ứng Vo, tốc độ tối đa Vmax, nồng độ cơ chất ban đầu [S] và hằng số Km. Theo phương trình trên, khi Vo = 1/2 Vmax thì:
Vmax/2 = Vmax[S] /Km + [S] (3.12) Chia 2 vế cho Vmax ta có:
1/2 = [S]/ km + [S]. Từ đó ta có: Km + [S] = 2[S]
Km = [S] khi V0 = 1/2 Vmax
Dựa vào phương trình này người ta dựng được đồ thị hyperbol phản ánh ảnh hưởng nồng độ cơ chất đến vận tốc ban đầu của phản ứng (hình 3.15).
8.2. Ý nghĩa của Vmax và Km.
Theo suy luận: Hằng số Km có giá trị tính theo mol bằng nồng độ tính theo mol của cơ chất ở thời điểm tốc độ phản ứng ban đầu do Enzyme xúc tác Vo bằng 1/2 Km. Để dễ dàng xác định Km và Vmax người ta lấy nghịch đảo cả hai vế phương trình Mchaelis- Menten:
1/V0 = Km +[S]/Vmax [S]
tách vế phải và đơn giản tiếp sẽ được phương trình Lineweaver – Burk 1/Vo = Km/Vmax –1/[S] +1/Vmax.
Đây là phương trình tuyến tính có dạng ( y= ax +b ) với đồ thị là đường thẳng cắt trục tung ở 1/Vmax, cắt trục hoành ở (-1/Km) và có độ nghiêng bằng (km/Vmax). Phương trình này cho phép dễ dàng xác định giá trị Vmax và Km trong một vài thí nghiệm xác định tốc độ Vo của phản ứng do Enzyme xúc tác với 1 số nồng độ cơ chất ban đầu (hình 3.16).
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 95
Hình 3.16. Biến đổi Lineveaver-Burk.
Trong các phản ứng Enzyme nhiều bậc, phần lớn Enzyme ở dạng EP, để cho thuận tiện người ta gọi hằng số giới hạn tốc độ phản ứng là Kcat. Ngoài ra, để biểu thị hoạt độ xúc tác người ta thường sử dụng khái niệm số chu trình quay của Enzyme được ký hiệu là Kcat/ s phản ánh số phân tử cơ chất biến đổi thành sản phẩm P trong một đơn vị thời gian bởi 1 phân tử Enzyme khi được bão hoà bởi cơ chất.
8.4. Sự ức chế hoạt tính Enzyme
Có 2 nhóm chất ức chế Enzyme: ức chế thuận nghịch và ức chế không thuận nghịch.
8.4.1. Nhóm chất ức chế thuận nghịch: Nhóm này được phân thành 3 nhóm phụ:
Ức chế cạnh tranh: Thể hiện sự ức chế bằng cách cạnh tranh trung tâm xúc tác Enzyme với cơ chất. Thông thường các chất ức chế cạnh tranh có hình dạng giống cơ chất, do đó dễ dạng tạo phức EI (I = inhibidor) và ngăn chặn tạo phức ES.
Vì là ức chế thuận nghịch nên có thể hạn chế ảnh hưởng của chất cạnh tranh bằng cách gia tăng nồng độ cơ chất.
Ức chế không cạnh tranh: Nhóm này có 2 nhóm phụ:
Nhóm chất ức chế không cạnh tranh: thể hiện ức chế bằng cách gắn lên vị trí gần tâm hoạt động Enzyme nhưng không ngăn cản cơ chất gắn lên tâm hoạt động. Chất ức chế không cạnh tranh gắn cả lên Enzyme ở trạng thái tự do cũng như lên phức ES làm giảm hoạt tính Enzyme, giảm Vmax nhưng hầu như không ảnh hưởng đối với Km.
Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Giáo trình Hoá Sinh động vật ……… 96
Ức chế bất cạnh tranh: Chất ức chế cũng gắn lên vị trí nằm gần tâm hoạt động Enzyme, nhưng chỉ gắn khi phức ES đã được tạo thành mà không gắn lên Enzyme tự do.
8.4.2. Nhóm chất ức chế không thuận nghịch.
Nhóm này ức chế Enzyme bằng cách tạo liên kết hoá trị với Enzyme.
Trong nhóm chất ức chế không thuận nghịch còn có một số chất ức chế khá đặc biệt. Bình thường chúng không hoạt động và chỉ bắt đầu hoạt động khi được gắn hoá trị với tâm hoạt động và làm mất hoàn toàn hoạt tính của Enzyme. Các chất ức chế này còn gọi là chất ức chế tự sát.