- Kính hiển vi quang học, kính lúp - Bộ kim lấy máu
- Lam kính và lamen - Thuốc nhuộm giemsa - Nước cất
- Dầu soi kính, cồn methanol, cồn 960
3.3. Nội dung nghiên cứu
3.3.1. Nghiên cứu một số đặc điểm dịch tễ bệnh Leucocytozoon ở vịt tại tỉnh Thái Nguyên
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon ở vịt tại các địa phương - Tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon ở vịt theo mùa
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon theo tuổi vịt
- Tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon theo điều kiện vệ sinh thú y
3.3.2. Nghiên cứu bệnh do đơn bào Leucocytozoon gây ra ở vịt tại tỉnh
Thái Nguyên
- Thành phần loài đơn bào Leucocytozoon ký sinh ở vịt tại các địa phương - Đặc điểm bệnh lý và lâm sàng bệnh Leucocytozoon ở vịt
3.3.3. Nghiên cứu biện pháp phòng và trị bệnh
Xác định hiệu lực và độ an toàn của phác đồ điều trị bệnh Leucocytozoon
cho vịt.
3.4. Bố trí thí nghiệm và phương pháp nghiên cứu
3.4.1. Phương pháp bố trí theo dõi xác định loài Leucocytozoon ký sinh ở vịt tại tỉnh Thái Nguyên
Các tiêu bản máu sau khi xét nghiệm thấy có đơn bào đường máu ký sinh, em tiến hành phân loại theo căn cứ vào hình thái của các loại đơn bào đã phát hiện được theo khóa định loại của Mathis et Leger, 1910.
3.4.2. Bố trí lấy mẫu và phương pháp xác định tỷ lệ, cường độ nhiễm Leucocytozoon ở vịt
3.4.2.1. Bố trí thu thập mẫu
Thu thập mẫu tại 4 huyện trên địa bàn tỉnh Thái Nguyên. Mỗi mẫu máu vịt làm 3 tiêu bản.
3.4.2.2. Phương pháp xác định tỷ lệ và cường độ nhiễm Lecocytozoon ở gà tại các địa phương
* Phương pháp thu thập mẫu
Mẫu máu được thu thập ngẫu nhiên từ vịt nuôi thả vườn tại các nông hộ, các trại chăn nuôi gà ở các địa phương của tỉnh Thái Nguyên.
Chuẩn bị những phiến kính mới đã được tẩy mỡ bằng cách ngâm và rửa xà phòng, sau đó ngâm trong cồn 960 trong 3 giờ rồi lau khô bằng khăn mềm không có xơ. Đồng thời, chọn những lamen kích thước 2 x 2 cm, rìa thật phẳng và nhẵn.
Trước khi lấy mẫu máu xét nghiệm, quan sát kỹ các biểu hiện lâm sàng của vịt. Dùng kim lấy 1 giọt máu tươi của vịt tại tĩnh mạch cánh, đặt lên phiến kính, cách bờ phiến kính khoảng 1 cm. Đặt cạnh của một lamen lên giọt máu, nghiêng 450 với phiến kính. Khi giọt máu đã tràn ra khắp cạnh của lamen thì đẩy lamen về phía trước, để cho máu được dàn thành một lớp mỏng và đều trên phiến kính. Cố định tiêu bản bằng cồn methanol. Làm 3 tiêu bản máu/ vịt. Tiêu bản được ghi số thứ tự bằng bút lông dầu. Ghi nhật ký thí nghiệm các thông tin: chủ hộ, địa chỉ, ngày lấy mẫu, tuổi vịt, phương thức chăn nuôi, trạng thái và màu sắc phân, điều kiện vệ sinh thú y, các biểu hiện lâm sàng.
* Chuẩn bị thuốc nhuộm giemsa cơ bản: Dung dịch giemsa mẹ
* Phương pháp nhuộm giemsa
Nguyễn Thị Kim Lan và cs. (2008) [5] […] cho biết: Nhuộm tiêu bản máu bằng thuốc nhuộm giemsa gồm 3 bước như sau:
- Bước 1: Pha thuốc nhuộm giemsa + Giemsa cơ bản: 1 phần
+ Nước cất trung tính (pH = 7,2): 9 phần
Nước cất để sẵn trong 1 cốc nhỏ có mỏ (100 ml), lấy dung dịch giemsa cơ bản bằng 1 pipet, nhỏ chậm giemsa vào cốc nước, không được lắc cốc.
- Bước 2: Đổ chậm dung dịch nhuộm vào hộp nhuộm cho ngập các tiêu bản, đậy nắp hộp nhuộm để tránh bụi
Thời gian nhuộm 15 – 20 phút - Bước 3: Lấy tiêu bản
Dùng 1 pince kẹp, cặp lần lượt từng tiêu bản và để nghiêng dưới vòi nước cất chảy nhẹ (pH = 7,2) cho trôi hết thuốc nhuộm dư thừa. Sau đó dựng nghiêng tiêu bản vào cạnh 1 cái hộp, để khô tự nhiên.
* Phương pháp kiểm tra tìm Leucocytozoon trên tiêu bản máu nhuộm giemsa
Nhỏ 1 giọt dầu soi kính lên tiêu bản, kiểm tra tiêu bản dưới kính hiển vi vật kính dầu, độ phóng đại 10 x 90 hoặc 10 x 100 để tìm Leucocytozoon.
Những mẫu máu tìm thấy đơn bào Leucocytozoon được xác định là có nhiễm, ngược lại là không nhiễm.
Cường độ nhiễm được xác định bằng tỷ lệ % số hồng cầu có đơn bào ký sinh và quy định các mức cường độ nhiễm: nhẹ, trung bình và nặng.
-Nhiễm mức độ nhẹ: ≤ 5% số hồng cầu có đơn bào ký sinh, đồng thời vịt không có biểu hiện lâm sàng.
-Nhiễm mức độ trung bình: > 5% – 10% số hồng cầu có đơn bào ký sinh, đồng thời vịt có một số triệu chứng lâm sàng nhưng chưa rõ rệt.
-Nhiễm mức độ nặng: > 10% số hồng cầu có đơn bào ký sinh, đồng thời vịt có triệu chứng lâm sàng rõ rệt.
3.4.2.3. Quy định một số yếu tố dịch tễ liên quan đến tình hình nhiễm đơn bào Leucocytzoon ở vịt
* Mùa: Thu thập 400 mẫu máu vịt tại các địa phương theo mùa trong
năm, số lượng mẫu thu thập theo từng mùa như sau: - Mùa Hè (từ tháng 6 đến tháng 8): 200 mẫu - Mùa Thu (từ tháng 9 đến tháng 11): 200 mẫu
* Lứa tuổi vịt: Thu thập 400 mẫu máu vịt tại các địa phương theo 4 lứa
tuổi, số lượng mẫu máu thu thập theo từng lứa tuổi như sau: - ≤ 2 tháng tuổi
- > 2 – 4 tháng tuổi - > 4 – 6 tháng tuổi - > 6 tháng tuổi
* Tình trạng vệ sinh thú y: Thu thập mẫu máu vịt tại các địa phương theo
các tình trạng VSTY như sau:
- VSTY tốt: chuồng trại cao ráo, thoáng mát, sạch sẽ, thường xuyên quyét dọn chuồng nuôi, khu vực xung quanh chuồng nuôi và bãi chăn thả, định kỳ phun thuốc khử trùng, thuốc diệt muỗi, dĩn, tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, phát quang cây cỏ, khơi thông cống rãnh.
- VSTY trung bình: không thường xuyên quét dọn chuồng nuôi, khu vực xung quanh chuồng nuôi, bãi chăn thả còn có những vũng nước đọng, thỉnh thoảng phun thuốc diệt muỗi, dĩn; không thường xuyên tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi và phát quang cây cỏ, không thường xuyên khơi thông cống rãnh ở gần khu vực chăn nuôi.
- VSTY kém: Chuồng nuôi, khu vực xung quanh chuồng nuôi và bãi chăn thả ẩm thấp, có nhiều vũng nước đọng, có nhiều bụi cây rậm rạp, không tiêu độc chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi, không khơi thông cống rãnh.
3.4.3. Phương pháp xác định quy luật hoạt động của dĩn – véc tơ truyền bệnh Leucocytozoon cho vịt theo tháng trong thời gian thực tập
Theo dõi sự xuất hiện và hoạt động của dĩn để xác định quy luật hoạt động của dĩn từ tháng 6 đến hết tháng 11, từ đó xác định được những tháng dĩn hoạt động mạnh và những tháng dĩn ngừng hoạt động. Kết quả này sẽ là cơ sở khoa học khuyến cáo người chăn nuôi có biện pháp diệt dĩn – véc tơ truyền Leucocytozoon cho gà phù hợp, hạn chế tác hại do bệnh Leucocytozoon
Những tháng dĩn hoạt động nhiều được kí hiệu (+++), tháng dĩn hoạt động bình thường thì ký hiệu (++), tháng dĩn hoạt động ít thì ký hiệu (+), dĩn ngừng hoạt động ký hiệu (-).
3.4.4. Phương pháp đánh giá hiệu lực và độ an toàn của phác đồ điều trị bệnh Leucocytozoon cho vịt
* Bố trí thí nghiệm
Bố trí thí nghiệm sử dụng 2 phác đồ điều trị cho những vịt có kết quả xét nghiệm máu là nhiễm Leucocytozoon theo sơ đồ sau:
Diễn giải Lô 1 Lô 2
Số vịt thí nghiệm 20 20 Phác đồ sử dụng và liều lượng - SU99 (1g/ 5 lít nước) - TOP – PHOSRETIC
(Giải độc gan) (1g/1 lít nước) - TOP – C 20% (1g/ 2 lít nước) - Vitamino (1ml/ 2 lít nước)
- Paradol K + C (hạ sốt) (1g/ 2 lít nước)
- Trimethoxin wsp (1g/ 1,5 lít nước) - TOP – PHOSRETIC
(Giải độc gan) (1g/1 lít nước) - TOP – C 20% (1g/ 2 lít nước) - Vitamino (1ml/ 2 lít nước)
- Paradol K + C (hạ sốt) (1g/ 2 lít nước) Liệu trình
(ngày) 10 10
* Thành phần thuốc có trong các phác đồ điều trị như sau:
- Trimethoxin: Sulfamonomethoxine Sodium 50g Trimethoprim 10g
Tá dược vừa đủ 100g
- SU 99: Sulfamonomethoxine Sodium 99g Tá dược vừa đủ 100g
- TOP – PHOSRETIC (Giải độc gan): Vitamin A (min) 500.000 UI Vitamin K3 (min) 500mg
- TOP – C 20%: Vitamin C (min) 200.000 mg Độ ẩm (max) 10%
Tá dược vừa đủ 1kg
- Vitamino: Vitamin E (min) 4.000 IU Methionine (min) 10.000 mg
- Paradol K + C (hạ sốt): Paracetamol 20g Vitamin C 10g
Tá dược vừa đủ 100g
* Phương pháp xác định hiệu lực và độ an toàn của phác đồ điều trị
Sử dụng 2 phác đồ điều trị cho những vịt bị bệnh Leucocytozoon. Sau khi cho vịt uống thuốc, hàng ngày lấy máu xét nghiệm bằng phương pháp dàn tiêu bản máu, nhuộm giemsa, kiểm tra dưới kính hiển vi để xác định hiệu quả của từng phác đồ điều trị. Tiếp tục theo dõi như vậy đến ngày thứ 10 sau dùng thuốc, nếu không tìm thấy đơn bào Leucocytozoon trong máu thì đánh giá thuốc có hiệu lực triệt để đối với Leucocytozoon, nếu vẫn tìm thấy
Leucocytozoon trong máu nhưng với số lượng giảm rõ rệt thì đánh giá thuốc
có hiệu lực với Leucocytozoon nhưng chưa triệt để. Nếu số lượng
Leucocytozoon trong máu không giảm hoặc giảm không đáng kể so với trước
khi dùng thuốc thì đánh giá thuốc không có hiệu lực với Leucocytozoon.
Theo dõi vịt sau dùng thuốc về các chỉ tiêu: ăn uống, vận động, và các phản ứng khác để xác định thuốc có an toàn hay không.
3.5. Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu thu thập được xử lý theo phương pháp thống kê sinh học (Nguyễn Văn Thiện, 2008) và trên phần mềm Microsoft Excel.
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thành phần loài đơn bào Leucocytozoon gây bệnh ở vịt tại tỉnh
Thái Nguyên
Để xác định loài đơn bào Leucocytozoon gây bệnh cho vịt tại tỉnh Thái Nguyên, em đã làm tiêu bản máu, nhuộm giemsa, đọc kết quả dưới kính hiển vi. Căn cứ theo mô tả của Levine N. D. (1985) [27] về hình thái của các loài đơn bào, em đã xác định được 1 loài đơn bào ký sinh và gây bệnh cho vịt tại tỉnh Thái Nguyên. Kết quả được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 4.1. Thành phần loài Leucocytozoon gây bệnh ở vịt tại Thái Nguyên
Địa phương Loài Leucocytozoon Số loài
phát hiện L. simondi Loài khác Huyện Đồng Hỷ + - 1 Huyện Đại Từ + - 1 Huyện Phú Lương + - 1 Huyện Phú Bình + - 1
Tần suất xuất hiện (%) 100 0 1
Bảng 4.1 cho thấy:
Đã định danh được 1 loài đơn bào thuộc giống Leucocytozoon gây bệnh cho vịt tại 4 địa phương tỉnh Thái Nguyên, đó là loài L. simondi. Loài L.
simondi phân bố rộng rãi và phổ biến, đều xuất hiện ở các địa phương nghiên
cứu. Trong các mẫu định loài tại 4 địa phương này không thấy xuất hiện các loài Leucocytozoon khác.
Loài đơn bào thấy ở 4 địa phương tỉnh Thái Nguyên có vị trí phân loại như sau:
Loài Leucocytozoon simondi (Mathis et Leger, 1910) thuộc giống
Leucocytozoon (Sambon, 1908), họ Leucocytozoidae (Doflein, 1916), bộ
Haemosporoda (Jacques Euzéby, 1988), lớp Aconoidasida (Mehlhorn, 1980),
ngành Apicomplexa (Levine, 1970).
Loài L. simondi: Đơn bào có dạng hình cầu, khi ký sinh trong tế bào hồng cầu của vịt, đơn bào này luôn làm cho nhân hồng cầu lệch sang một bên và hồng cầu của vịt có hình gần tròn.
Hình thái của loài đơn bào phát hiện được trên vịt ở Thái Nguyên hoàn toàn phù hợp với mô tả của Levine N. D. (1985) [27].
Theo Phạm Sỹ Lăng (2010) [8]: Ở Việt Nam, loài Leucocytozoon ký sinh và gây bệnh chủ yếu cho đàn vịt là L. simondi. Kết quả nghiên cứu trên những mẫu máu vịt thu thập tại 4 địa phương thuộc tỉnh Thái Nguyên chỉ thấy xuất hiện 1 loài đơn bào ký sinh và gây bệnh cho vịt là L.simondi.
Theo Nguyễn Thị Kim Lan (2012) [6], ngoài ký sinh trong hồng cầu, đôi khi còn thấy đơn bào Leucocytozoon ký sinh trong bạch cầu (của gà). Tuy nhiên, trên những tiêu bản máu vịt kiểm tra tại các địa phương của tỉnh Thái Nguyên, em chỉ phát hiện thấy đơn bào Leucocytozoon ký sinh trong hồng cầu, không thấy tiêu bản nào có đơn bào Leucocytozoon ký sinh trong bạch cầu.
4.2. Một số đặc điểm dịch tễ bệnh đơn bào Leucocytozoon ở vịt tại tỉnh
Thái Nguyên
4.2.1. Tình hình nhiễm đơn bào đường máu Leucocytozoon ở vịt
4.2.1.1. Tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon ở vịt theo địa phương
Để đánh giá được tỷ lệ và cường độ nhiễm đơn bào Leucocytozoon theo địa phương, em đã tiến hành thu thập và xét nghiệm 400 mẫu máu vịt ở huyện Đồng Hỷ, huyện Đại Từ, huyện Phú Lương, huyện Phú Bình thuộc tỉnh Thái Nguyên. Kết quả được trình bày ở bảng 4.2.
Bảng 4.2. Tỷ lệ và cường độ nhiễm Leucocytozoon ở vịt theo địa phương Địa phương Số vịt xét nghiệm (con) Số vịt nhiễm (con) Tỷ lệ nhiễm (%) Cường độ nhiễm (% số hồng cầu có đơn bào) ≤ 5 > 5 – 10 > 10 n % n % n % Huyện Đồng Hỷ 100 19 19,00 8 42,10 11 57,90 0 0,00 Huyện Đại Từ 100 6 6,00 4 66,67 2 33,33 0 0,00 Huyện Phú Lương 100 12 12,00 9 75,00 2 16,67 1 8,33 Huyện Phú Bình 100 27 27,00 14 51,85 7 25,92 6 22,23 Tổng 400 64 16,00 35 54,69 22 34,37 7 10,94
Qua điều tra cho thấy: vịt nhiễm đơn bào Leucocytozoon đều xuất hiện ở các địa phương nghiên cứu. Tuy nhiên tỷ lệ và cường độ nhiễm của vịt tại các địa phương lại không giống nhau. Nguyên nhân là do điều kiện tự nhiên và điều kiện kinh tế xã hội có ảnh hưởng lớn đến sự phân bố dĩn – véc tơ truyền bệnh đơn bào Leucocytozoon. Đây chính là nguyên nhân trực tiếp và gián tiếp dẫn đến sự khác nhau về tỷ lệ và cường độ nhiễm giữa các địa phương.
Trong tổng số 400 vịt được xét nghiệm máu có 64 vịt nhiễm đơn bào
Leucocytozoon, tỷ lệ nhiễm chung ở 4 địa phương là 16,00%; biến động từ
6,00% – 27,00% theo từng địa phương. Trong đó, vịt ở huyện Phú Bình nhiễm với tỷ lệ là 27,00% chiếm tỷ lệ cao nhất.
Qua điều tra cho thấy, đa số các hộ chăn nuôi vịt đều chưa chú ý xây dựng chuồng trại hợp vệ sinh, một số hộ còn làm chuồng tạm bợ, khu vực xung quanh chuồng nuôi còn nhiều rãnh nước đọng... Các hộ dân cũng chưa chú ý tới việc vệ sinh chuồng, khu vực xung quanh chuồng. Đặc biệt số hộ chăn nuôi sử dụng thuốc phun diệt dĩn và dùng thuốc phòng bệnh đơn bào
Leucocytozoon cho vịt còn rất ít. Đây cũng là nguyên nhân này làm cho tỷ lệ
* Về cường độ nhiễm:
Vịt ở các địa phương đều nhiễm Leucocytozoon. Tính chung trong tổng số 64 vịt nhiễm thì chủ yếu là nhiễm ở cường độ nhẹ với 54,69%, vịt nhiễm ở cường độ trung bình chiếm tỷ lệ 34,37%, cường độ nặng chiếm 10,94%. Cụ thể như sau:
- Huyện Đồng Hỷ: Tính chung trong tổng số 19 vịt nhiễm có 8 vịt nhiễm ở cường độ nhẹ, chiếm 42,10%; 11 vịt nhiễm ở cường độ trung bình, chiếm 57,90%; không có vịt nhiễm ở cường độ nặng.
- Huyện Đại Từ: Có 66,67% nhiễm ở cường độ nhẹ, 33,33% vịt nhiễm ở cường độ trung bình và không có vịt nhiễm ở cường độ nặng.
- Huyện Phú Lương: Có 9/12 vịt nhiễm Leucocytozoon ở cường độ nhẹ, chiếm 75,00%; 2 vịt nhiễm ở cường độ trung bình, chiếm 16,67%; 1 vịt nhiễm ở cường độ nặng, chiếm 8,33%.
- Huyện Phú Bình: Số lượng vịt nghiên cứu có cường độ nhiễm cao nhất trong 4 địa phương. Với 14 vịt trên tổng số 27 vịt nhiễm ở cường độ nhẹ, chiếm tỷ lệ 51,85%; 7 vịt nhiễm ở cường độ trung bình, chiếm 25,92%; 6 trường hợp nhiễm ở cường độ nặng, chiếm 22,23%.
Theo Lê Văn Năm (2011) [9] và Nguyễn Thị Kim Lan (2012) [6], mức độ nặng nhẹ của bệnh Leucocytozoon phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: tuổi gia cầm thụ cảm, mùa vụ, phương thức chăn nuôi, điều kiện vệ sinh thú y, kỹ thuật chăm sóc nuôi dưỡng…
Kết quả điều tra cho thấy, 4 địa phương thuộc tỉnh Thái Nguyên chịu sự ảnh hưởng của khí hậu vùng trung du miền núi phía Bắc, khô lạnh và ít mưa về mùa Đông, nóng ẩm, mưa nhiều về mùa Hè. Đây là điều kiện thuận lợi cho các loại dĩn hút máu cư trú và phát triển. Ngoài ra, điều kiện kinh tế xã hội cũng có những nét riêng. Nhìn chung, các địa phương ở xa khu vực trung tâm tỉnh, các điều kiện về chăn nuôi và vệ sinh thú y còn yếu kém, người dân vẫn