3.6.1.1. Xây dựng quy trình phân tích mẫu
Để xây dựng quy trình phân tích mẫu, chúng tôi tiến hành nghiên cứu các điều kiện phân tích mẫu tối ưu.
Nghiên cứu điều kiện vô cơ hóa mẫu
Việc xử lý mẫu phân tích được thực hiện theo nhiều kỹ thuật có nguyên lý, bản chất, cơ chế vật lý và hóa học khác nhau, tùy theo mỗi loại mẫu và yêu cầu phân tích. Khi xử lý mẫu bằng phương pháp vô cơ hóa, thường sử dụng các kỹ thuật như: vô cơ hóa ướt, vô cơ hóa khô, vô cơ hóa khô và ướt kết hợp. Quá trình được thực hiện trong một hệ hở hoặc hệ kín, dưới áp suất thường hoặc áp suất cao.
Trong các kỹ thuật vô cơ hóa mẫu thì vô cơ hóa ướt (xử lý ướt) là kỹ thuật được nhiều tác giả sử dụng để xác định selen tổng trong các mẫu sinh vật. Trong kỹ thuật này, người ta thường dùng các axít mạnh, đặc (HCl, H2SO4) hay axít mạnh, đặc, có tính ôxy hóa mạnh (HNO3, HClO4) hoặc hỗn hợp hai, ba axít như (HNO3 + H2SO4), (HNO3 + H2SO4 + HClO4) hoặc có thể sử dụng hỗn hợp axít và một chất ôxy hóa như H2O2, KMnO4 v.v… Có thể được tiến hành trong cốc thủy tinh, bình Kendan hay trong hộp kín và được đun nóng trên bếp điện, trong tủ sấy hoặc trong lò vi sóng v.v.. Hiện nay, kỹ thuật xử lý ướt trong bình Kendan và trong lò vi sóng hệ kín đang được sử dụng nhiều [100,105].
Laura Hinojosa Reyes và CCS [1] đã sử dụng phương pháp xử lý ướt trong lò vi sóng dùng hỗn hợp (HNO3 + H2O2) để xác định asen và selen trong mô cá. A. M. Higham và CCS [35] đã tiến hành xác định selen trong cá ngừ và so sánh kết quả thu được bằng phương pháp xử lý ướt sử dụng các hỗn hợp axít khác nhau (HNO3 + H2SO4), (H3PO4 + HNO3 + H2O2) và phương pháp kết hợp khô và ướt sử dụng hỗn hợp (HNO3 + Mg(NO3)2) đun nóng đến khô sau đó tro hóa ở 5000C. Đinh
Thị Trường Giang và CCS bằng phương pháp xử lý ướt sử dụng hỗn hợp axít (nước cường thủy + H2SO4) đã xác định selen trong các mẫu hải sản (ngao, cá, sò) [103]. Vũ Đức Lợi và CCS đã áp dụng phương pháp vô cơ hóa ướt dùng hỗn hợp ba axít (HNO3 + H2SO4 + HClO4) để xác định tổng Hg trong các mẫu tóc và cá [92].
Với mục đích xác định hàm lượng selen tổng trong hải sản, chúng tôi chọn phương pháp xử lý ướt sử dụng hỗn hợp ba axít (HNO3 + H2SO4 + HClO4) để vô cơ hóa mẫu nhằm vô cơ hóa được triệt để và rút ngắn thời gian phá mẫu trong điều kiện thực tế của phòng thí nghiệm. Quy trình phá mẫu này đã được TS. VũĐức Lợi và CCS [92] cùng với phòng Hóa Phân tích - Viện Hóa học nghiên cứu kỹ và áp dụng để phân tích hàm lượng nhiều nguyên tố và trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau. Qua tham khảo quy trình đồng thời dựa trên nghiên cứu thực nghiệm, chúng tôi tiến hành vô cơ hóa mẫu theo quy trình sau:
Cân chính xác khoảng 0,01g mẫu hải sản khô đông (đã được xử lý theo mục 2.2.2)cho vào bình Kendan, thêm vào 2ml hỗn hợp axít (HNO3 + HClO4) đậm đặc tỉ lệ (1:1), thêm tiếp 5ml axít H2SO4 đặc, lắc đều và đặt vào miệng bình phễu thủy tinh nhỏ. Đun nóng hỗn hợp ở nhiệt độ 2500C trên bếp điều nhiệt cho tới khi mẫu trong và không màu (khoảng 3÷4h), sau đó đổ hỗn hợp ra cốc thủy tinh chịu nhiệt và cô cạn hết axít dưđến khi thu được muối trắng ẩm. Sản phẩm thu được tiếp tục xử lý để khử Se(VI) về Se(IV).
Nghiên cứu điều kiện khử Se(VI) về Se(IV)
Để xác định hàm lượng Se tổng trong mẫu hải sản bằng phương pháp Von- Ampe hòa tan catot, cần phải chuyển tất cả các dạng selen hữu cơ về selen vô cơ (Se(IV) và Se(VI)) và sau đó khử dạng Se(VI) không hoạt động điện hóa về dạng Se(IV) hoạt động điện hóa. Giai đoạn này phải sử dụng một tác nhân khử như: HCl đặc, HBr hoặc hỗn hợp (HCl + KBr),… trong điều kiện đun nóng hoặc chiếu UV.
A. M. Higham và CCS [35] đã xác định selen trong cá ngừ bằng phương pháp DPCSV dùng HCl 6M trong điều kiện đun cách thủy để khử Se(VI) về Se(IV).
P. Papoff và CCS [7] đã khử Se(VI) về Se(IV) khi xác định selen trong nước biển và trong tuyết bằng phương pháp DPCSV bằng cách chiếu UV ở pH = 10 (dùng NH3 25%) trong 40 phút đạt được độ thu hồi Se(IV) là (100 ± 1)%. Đồng thời các tác giả này cũng tổng hợp các nghiên cứu về điều kiện khử Se(VI) về Se(IV)
của các tác giả khác như: để xác định selen trong mẫu nước sông bằng phương pháp DPCSV, sau khi vô cơ hóa mẫu bằng HNO3 đặc trong lò vi sóng, tiến hành khử Se(VI) về Se(IV) dùng axít HCl 4M, đun nóng 15 phút trong lò vi sóng đạt được độ thu hồi Se(IV) là (100 ± 2) % và nếu dùng axít HCl 2M, 3M độ thu hồi Se(IV) chỉ đạt được lần lượt là (70 ± 3) % và (81 ± 2) %; khi xác định selen trong nước sinh hoạt bằng phương pháp DPCSV, mẫu được chạy qua cột chelex-100, sau đó khử Se(VI) về Se(IV) bằng HCl 6M đun cách thủy 20 phút đạt được độ thu hồi 100% v.v.. Maria Ochsenkühn-Petropoulou và CCS [9] đã xác định dạng Se(VI) trong trầm tích bằng phương pháp DPCSV trên cơ sở khử Se(VI) về Se(IV) bằng cách chiếu UV 4h trong HCl 5M.
Trên cơ sở tham khảo các tài liệu, đồng thời để phù hợp với nền điện li khi xác định bằng phương pháp Von-Ampe hòa tan, chúng tôi chọn phương pháp khử Se(VI) về Se(IV) bằng cách đun cách thủy trong axít HCl. Để tìm được điều kiện tối ưu cho quá trình khử, chúng tôi tiến hành nghiên cứu chọn nồng độ HCl và thời gian khử tối ưu.
- Ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất khử Se(VI) về Se(IV)
Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất khử Se(VI) về Se(IV), chúng tôi chuẩn bị 10ml dung dịch Se(VI) có nồng độ không đổi 20ppb và thay đổi nồng độ HCl. Cho toàn bộ dung dịch vào bình Kendan, đặt vào miệng bình một phễu thủy tinh và đun cách thủy ở 90-1000C trong 50 phút. Lấy dung dịch sau khử pha loãng và định mức bằng nước cất siêu sạch đến 100ml. Lấy 10ml dung dịch đem ghi đo DPCSV. Kết quả thu được được chỉ ra trong bảng 3.40.
Bảng 3.40: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ HCl đến hiệu suất khử Se(VI) về Se(IV) CHCl 1M 2M 3M 4M 5M 6M 7M 8M Hàm lượng Se(IV) tìm thấy (ppb) 0,820 0,978 1,199 1,367 1,589 1,705 1,634 1,607 Hiệu suất khử (%) 46,2 55,1 67,5 77,0 89,5 96,0 92,0 90,5
- Ảnh hưởng của thời gian khửđến hiệu suất khử Se(VI) về Se(IV)
Chúng tôi chuẩn bị 10ml dung dịch gồm: Se(VI) 20ppb, HCl 6M và tiến hành khử trong những thời gian khác nhau. Dung dịch sau khử được pha loãng và định mức bằng nước cất siêu sạch đến 100ml. Lấy 10ml dung dịch đem ghi đo DPCSV, kết quảđược chỉ ra trong bảng 3.41.
Bảng 3.41: Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian khử đến hiệu suất khử Se(VI) về Se(IV) Thời gian khử (phút) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Hàm lượng Se(IV) tìm thấy (ppb) 1,278 1,341 1,478 1,575 1,678 1,820 1,740 1,712 1,657 1,581 Hiệu suất khử (%) 72,0 75,5 83,2 88,7 94,5 102,5 98,0 96,4 93,3 89,0
Kết quả nghiên cứu cho thấy, thời gian tối ưu để khử Se(VI) về Se(IV) là 50÷90 phút. Tuy nhiên, để hiệu suất khử cao nhất, chúng tôi chọn thời gian khử là 60 phút.
Sau khi nghiên cứu, khảo sát, chúng tôi đưa ra quy trình phân tích hàm lượng Se tổng trong mẫu hải sản được tóm tắt theo sơđồ hình 3.40.
Hình 3.40: Quy trình xác định Se tổng trong mẫu hải sản 3.6.1.2. Đánh giá phương pháp
Để đánh giá độ chính xác của phương pháp, chúng tôi sử dụng mẫu chuẩn Quốc Tế DORM-2 (Dogfish muscle certified reference material for trace metals) để tiến hành định lượng Se tổng theo quy trình trên. Tuy nhiên, do hàm lượng Se trong mẫu chuẩn nhỏ nên chúng tôi lấy lượng mẫu ban đầu nhiều hơn so với quy trình. Cân 0,05g mẫu chuẩn DORM-2 cho vào bình Kendan, thêm vào mẫu 2ml dung dịch hỗn hợp axít (HNO3 + HClO4) đậm đặc tỉ lệ (1:1), thêm tiếp 5ml H2SO4 đậm đặc, đặt phễu thủy tinh nhỏ vào miệng bình. Đun mẫu trên bếp điều nhiệt ở 2500C trong 3-4 giờ cho đến khi mẫu trong và không màu, đổ mẫu sang cốc thủy tinh chịu nhiệt và cô cạn hết axít dưđến khi thu được muối trắng ẩm. Hòa tan muối bằng 10ml HCl 6M và đun cách thủy ở nhiệt độ 90-1000C trong 60 phút để chuyển toàn bộ lượng Se(VI) trong mẫu về Se(IV). Pha loãng mẫu bằng nước cất siêu sạch
0,01 gam mẫu 2ml (HNO3 + HClO4) (1:1) 5ml H2SO4 2500C Mẫu được vô cơ hóa Cô cạn Muối trắng ẩm HCl 6M 90-1000C Se(IV) Ghi đo DPCSV 3-4h 60ph
và định mức đến 100ml. Hút 10ml dung dịch mẫu, tiến hành ghi đo DPCSV theo các điều kiện tối ưu đã đưa ra trong bảng 3.13 với thời gian điện phân 90s, sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định hàm lượng Se tổng trong mẫu. Kết quảđược lấy trung bình sau 3 lần ghi đo mẫu.
Để nghiên cứu độ thu hồi Se trong mẫu chuẩn, chúng tôi chuẩn bị mẫu thêm như sau: cân 0,05g mẫu DORM-2 cho vào bình Kendan, thêm vào mẫu 70µl Se(IV) (1000 µg/l Se), khi đó lượng Se thêm vào mẫu là 0,07µg. Tiến hành phá mẫu và định lượng tương tự như mẫu chuẩn. Kết quả nghiên cứu thu được (xem phần phụ lục) sử dụng để tính toán độ thu hồi theo công thức:
Rev (%) = (C2 – C1)×100/C0 (*) Trong đó: +C2 – Nồng độ mẫu đã thêm
+C1 – Nồng độ mẫu thực +C0 – Nồng độ thêm vào
Các kết quả phân tích được chỉ ra trong hình 3.41 và bảng 3.42.
-2.00e-6 -1.00e-6 0 1.00e-6 2.00e-6
c (g/L) 0 -5.00n -10.0n -15.0n -20.0n -25.0n -30.0n I ( A ) -6.8e-007 Se c = 0.682 µg /L +/- 0.051 µg /L (7.48 %)
-2.00e-6 -1.00e-6 0 1.00e-6 2.00e-6
c (g/L) 0 -5.00n -10.0n -15.0n -20.0n -25.0n -30.0n I ( A ) -6.8e-007 Se c = 0.682 µg /L +/- 0.051 µg /L (7.48 %)
Hình 3.41: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn xác định hàm lượng Se tổng trong mẫu chuẩn DORM-2
Bảng 3.42: Kết quả phân tích hàm lượng Se tổng trong mẫu chuẩn DORM-2
Mẫu chuẩn Hàm lượng selen tổng Độ thu hồi Rev (%) Giá trị chứng chỉ (mg/kg) Kết quả phân tích (mg/kg) Sai số so với giá trị chứng chỉ Lần 1 Lần 2 Lần 3 TB DORM-2 1,400 ± 0,09 1,364 ±0,102 1,342 ±0,096 1,312 ±0,126 1,339 ±0,108 4,36% 91,64
Từ kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, sai số giữa kết quả xác định theo phương pháp nghiên cứu và giá trị chứng chỉ là không đáng kể. Do đó có thể kết luận: Phương pháp DPCSV mà chúng tôi nghiên cứu có độ chính xác cao.
3.6.1.3. Áp dụng phân tích hàm lượng selen tổng trong mẫu hải sản
Trên cơ sở quy trình phân tích đã xây dựng, chúng tôi tiến hành phân tích, xác định hàm lượng selen tổng trong các mẫu hải sản.
Cân 0,01g mẫu hải sản khô đông cho vào bình Kendan, thêm vào mẫu 2ml dung dịch hỗn hợp (HNO3 + HClO4) tỉ lệ (1:1) và 5ml H2SO4 đậm đặc, đặt phễu thủy tinh nhỏ vào miệng bình. Đun mẫu trên bếp điều nhiệt ở 2500C trong 3-4giờ cho đến khi mẫu trong và không màu, đổ mẫu sang cốc thủy tinh chịu nhiệt và cho bay hơi hết axít dư cho đến khi thu được muối trắng ẩm. Hòa tan muối bằng 10ml HCl 6M và đun cách thủy ở nhiệt độ 90-1000C trong 60 phút để chuyển toàn bộ lượng Se(VI) trong mẫu về Se(IV). Pha loãng mẫu bằng nước cất siêu sạch và định mức đến 100ml. Hút 10ml dung dịch mẫu, tiến hành ghi đo DPCSV theo các điều kiện tối ưu đã đưa ra trong bảng 3.13 với thời gian điện phân thay đổi tùy theo từng mẫu và sử dụng phương pháp thêm chuẩn để xác định hàm lượng Se tổng trong mẫu hải sản. Kết quảđược lấy trung bình sau 3 lần ghi đo mẫu.
Để nghiên cứu độ thu hồi selen trong các mẫu hải sản, chúng tôi chuẩn bị mẫu thêm như sau: cân 0,01g mỗi mẫu hải sản khô đông cho vào bình Kendan,
thêm vào mẫu 50µl Se(IV) (10.000 µg/l Se), khi đó lượng Se thêm vào mỗi mẫu là 0,5µg. Tiến hành phá mẫu và định lượng tương tự như mẫu thật. Kết quả nghiên cứu thu được (xem phần phụ lục) sử dụng để tính toán độ thu hồi theo công thức (*).
Kết quả phân tích mẫu được thể hiện trên các hình từ 3.42 đến 3.46.
* Mẫu Ngao
Hình 3.42: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn mẫu Ngao
* Mẫu cá Khoai
* Mẫu tôm Sú
Hình 3.44: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn mẫu tôm Sú
* Mẫu Mực
* Mẫu cá Thu
Hình 3.46: Đường DPCSV và đồ thị thêm chuẩn mẫu cá Thu
Tổng hợp các kết quả thu được thể hiện ở bảng 3.43.
Bảng 3.43: Kết quả xác định hàm lượng Se tổng trong các mẫu hải sản Mẫu (µg/g)
Số lần ghi đo Ngao Cá Khoai Tôm Sú Mực Cá Thu
Lần 1 105,39 52,78 15,46 41,80 86,86 Lần 2 106,30 51,68 14,90 42,17 86,57 Lần 3 105,65 50,98 15,12 43,13 85,98 Giá trị trung bình 105,78 51,81 15,16 42,37 86,47 Độ lệch chuẩn 0,656 0,907 0,282 0,686 0,448 Độ lệch chuẩn trung bình 0,379 0,524 0,163 0,396 0,259 Rev (%) 109,24 97,22 96,26 91,96 93,08
3.6.1.4. Kết quả ghi đo quang phổ hấp thụ nguyên tử lò graphit (GFAAS) của một số mẫu hải sản
Bên cạnh việc xác định hàm lượng selen tổng trong hải sản bằng phương pháp DPCSV, chúng tôi còn xác định hàm lượng selen tổng trong một số mẫu đại diện bằng phương pháp GFAAS với mục đích:
- Đánh giá khách quan kết quả thực nghiệm của phương pháp đã chọn.
- Tìm hiểu thêm về các phương pháp quang phổ và so sánh các phương pháp phân tích định lượng với nhau.
Kết quả ghi đo một số mẫu hải sản bằng phương pháp GFAAS được tổng kết trong bảng 3.44.
Bảng 3.44: Kết quả ghi đo quang phổ hấp thụ nguyên tử lò graphit của một số mẫu hảisản
Mẫu (µg/g)
Số lần ghi đo Ngao Tôm Sú Cá Thu
Lần 1 115,73 16,79 88,23 Lần 2 117,54 13,98 89,67 Lần 3 120,52 16,24 89,58 Giá trị trung bình 117,93 15,67 89,16 Độ lệch chuẩn 2,419 1,489 0,807 Độ lệch chuẩn trung bình 1,396 0,860 0,466
Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy, phương pháp GFAAS có độ chính xác cao, xác định hàm lượng các nguyên tố trong mẫu một cách nhanh chóng, điều này rất thuận tiện để xác định hàm lượng mẫu hàng loạt, đặc biệt là xác định hàm lượng tổng nguyên tố trong mẫu cần phân tích. Tuy nhiên, dựa vào độ lệch chuẩn và độ lệch chuẩn trung bình giữa các kết quả ghi đo thì phương pháp DPCSV cho độ lặp lại tốt hơn phương pháp GFAAS.
Bảng 3.45: So sánh kết quả nghiên cứu thu được theo hai phương pháp: DPCSV và GFAAS
Mẫu (µg/g)
Phương pháp Ngao Tôm Sú Cá Thu
DPCSV 105,78 15,16 86,47
GFAAS 117,93 15,67 89,16
Sai số tương đối giữa hai
phương pháp 11,49% 3,36% 3,11%
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng giữa hai phương pháp DPCSV và GFAAS sai lệch không đáng kể. Cùng với kết quả phân tích mẫu chuẩn, chứng tỏ phương pháp
DPCSV xây dựng được có độ tin cậy và độ chính cao, cho phép xác định nhạy lượng vết selen trong các mẫu sinh học.
Qua kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng selen trong mẫu Ngao lớn nhất, tiếp đến là cá Thu, cá Khoai, Mực và nhỏ nhất là trong tôm Sú. Các kết quả chứng tỏ rằng những động vật sống dưới đáy tích lũy selen lớn hơn so với những động vật sống ở tầng cao hơn.