VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2.2.Tiến hành ly trích
Ly trích sử dụng SDS, NaOH và sốc nhiệt
Nguyên tắc của việc ly trích này là dựa trên sự phối hợp cơ học (nghiền), hóa học (NaOH, SDS) và sốc nhiệt để tách chiết ADN virus ra dịch chiết. Quy trình tách chiết bao gồm các bước sau:
- Cho mẫu tôm vào ống eppendorf 1,5 ml, thêm vào 100 µl dung dịch tách chiết, rồi dùng chày nhỏ nghiền nhuyễn. Sau đó tiếp tục thêm 500 – 700 µl dung dịch tách chiết, tiếp tục nghiền cho đến khi thấy mẫu được nghiền nhuyễn hoàn toàn (có thể gắn chày vào một đầu khoan điện để nghiền cho nhanh). Nếu thao tác nhiều mẫu thì nên giữ lạnh trên đá cho đến khi chuyển qua bước tiếp theo.
- Chuyển các ống nghiệm này sang bếp cách thủy đang sôi, hay lên một bếp nhiệt khô ở 960C, giữ yên 5 – 10 phút. Sau đó lấy ra và làm lạnh nhanh các ống nghiệm trên đá trong vài phút.
- Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút. Sử dụng phần dịch nổi cho phân tích R e a l - t i m e PCR hoặc bảo quản lạnh ở – 200C trong vòng một tuần (khi mẫu chưa được phân tích ngay).
Ly trích sử dụng SDS, NaOH và sốc nhiệt kết hợp với Instagene Matrix
Sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt. Tiến hành sử dụng bộ ly trích Instagene Matrix để tinh sạch và thu nhận nhiều ADN. Quy trình như sau:
- Hút 20 µl phần dịch nổi sau khi ly trích bằng SDS, NaOH và sốc nhiệt cho vào ống eppendorf 1,5 ml. Sau đó thêm 200 µl dung dịch Instagene Matrix (đã được khuấy từ trước đó 15 phút) vào trong ống.
- Tiến hành ủ ở nhiệt độ 56oC trong vòng 15 - 30 phút, lấy ra vortex (đảo) mạnh 10 giây.
- Tiếp tục ủ 100oC trong 8 - 10 phút, lấy ra vortex mạnh 10 giây.
- Ly tâm 13000 vòng trong 3 phút. Sử dụng phần dịch nổi để phân tích Real - time PCR hay bảo quản lạnh - 20 oC trong vòng một tuần.